Капацитет на диференциация на човешки аортни периваскуларни адипозни прогениторни клетки (в превод

Обобщение

Целта на този протокол е да се тества способността на прогениторните клетки, получени от човешката периваскуларна мастна тъкан, да се диференцират в множество линии на клетката. Диференциацията е сравнена с мезенхимни стволови клетки от човешки костен мозък, за които е известно, че се диференцират в адипоцитна, остеоцитна и хрущялна клетъчна линия.

Резюме

Въведение

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Използването на човешки тъкани в това проучване беше оценено и одобрено от Институционалния съвет за преглед на Медицински център в Мейн и целият персонал получи подходящо обучение преди експерименти.

2. Протокол 1: Култивиране на човешки PVAT клетки от стромалната съдова руптура

Забележка: PVAT се резецира от мястото на присадената анастомоза към възходящата аорта при анестезиран пациент с коронарен байпас ангиопластика. Аортният PVAT се поставя в 15 ml коничен с 10 ml ледено студен глюкозен DMEM-F12 и се прехвърля в лабораторията от операционната в рамките на 2 часа след резекцията. Аортният PVAT се изхвърля тъкан по време на байпас процедури и се държи като изследване на нечовешки субекти от отдела за вътрешен одит на Мейн медицински център.

    Този протокол е за

500 mg парче човешки PVAT (приблизително 3 x 1 x 0,5 cm 3). Прехвърлете пресен човешки PVAT от DMEM в 50 ml конична епруветка, съдържаща 25 ml антибиотичен разтвор. Инкубирайте с рокиген за 20 минути при 4 ° C. Докато PVAT е в антибиотичен разтвор, размразете аликвотна част от дисоциационния буфер при 37 ° C. Добавете 5 ml дисоциационен буфер 50 µL 100 X антибиотичен/противогъбичен разтвор и стерилизирайте с 0,22 µm филтър за спринцовка. 1 също добавете 1 ml желатинов разтвор от 24-ямкова плоча. В качулка с ламинарен поток използвайте стерилни пинсети и ножици, за да прехвърлите PVAT от антибиотичния разтвор в стерилна чашка на Петри. Добавете 1 ml предварително затоплен дисоциационен буфер към тъканта и нарязайте фино цялата тъкан на каша (не парче по-голямо от

Добавете 1 mL прясна хранителна среда и разпределете 500 µL, 2 гнезда от 24-гнездова плака, всяка с 500 µL среда за растеж и 25 ng FGF2.

  • Също така, клетките, получени от човешки PVAT, продължават да се разширяват, както е посочено в предишната стъпка. Всеки пасаж не трябва да бъде по-голям от разделяне 1: 2. Клетките се пасажират 5-7 пъти, преди да бъдат разпределени за анализи на диференциацията.

    • 3. Протокол 2: Култура на човешки костен мозък в МСК колонии

    Забележка: MSC на човешки костен мозък, изолиран, както е описано 8, и съхраняван като запаси за ранно преминаване в замразена среда за замразяване (70% FBS, 20% базален DMEM и 10% DMSO)

    100 000 клетки/ml в течен N2.

    1. Бързо размразявайте флакона с костния мозък на MSC от течния N2 във водна баня и плака с температура 37 ° C до кладенец на 6-гнездова културна плака с 3 mL среда за растеж на MSC и инкубирайте една нощ при 37 ° C и 5% CO2.
    2. На следващия ден аспирирайте MSC културална среда и измийте клетките 3 пъти в 2 mL HBSS. При 100% сливане аспирирайте растежната среда и измийте клетките 3 пъти в 2 mL HBSS. Добавете 500 µL/ямка от разтвор за отделяне на клетки и инкубирайте при 37 ° C и 5% CO2 за 5 минути. Почукайте плочата, за да се уверите, че всички клетки са изместени, и разпределете съдържанието равномерно в 2 гнезда в 6-ямкова плака, съдържаща 2 ml MSC среда за растеж.
    3. Разширяване в човешкия костен мозък и получените от PVAT MSC паралелно за приблизително 5 - 7 пасажи или докато се достигнат достатъчни количества за тестване.

    4. Протокол 3: Поставете и индуцирайте адипогенни, остеогенни и хондрогенни линии

      Съответните номера на плочите на костния мозък и PVAT клетките се възстановяват на кладенче от 12-ямкова плака и се репликират по подходящ начин за всяко експериментално състояние. За адипогенни и остеогенни състояния,

    5. Протокол № 4: Култура на адипогенни, остеогенни и хондрогенни линии в продължение на 14 дни

    6. Протокол № 5: оцветяване на адипогенното състояние с маслено червено О

    7. Протокол 6: оцветяване на остеогенното състояние с ализариново червено

    1. Отстранете цялата течност от всяка ямка. Добавете подходящи обеми от 2% разтвор на петна от ализариново червено към всяка ямка (1,5 ml на гнездо за плоча с 12 гнезда) и внимателно наклонете плаката от една страна на друга, докато разтворът напълно покрие дъното на ямката.
    2. Инкубирайте 15 минути при стайна температура. Извадете ализариново червено от кладенеца. Изплакнете всяка ямка четири пъти с дестилирана вода, като внимавате да не изместите внимателно калциевите кристали. оставете да изсъхне.

    8. Протокол 7: Оцветяване на хондрогенно състояние с Masson Trichrome

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Представителни резултати

    Изолиране на съдова фракция на стромални клетки от човешки PVAT

    Фигура 1А показва схематично изображение на анатомичната област, която е определена над възходящата аорта PVAT. Групите пациенти при операция на байпас на коронарните артерии, тези проби, получени от 6, са описани по-рано - Фигура 1b показва пример за човешки PVAT, получен след операция. илюстрация 1 показва представителен разрез от PVAT плат, оцветен с петно ​​Masson Trichrome. илюстрация 1 е микрофаза с фазов договор, показваща популация от стромени клетки, получени от PVAT, по време на фазата на разширяване преди диференциацията. Клетките могат да бъдат разширени и замразени за бъдеща употреба. Клетките обикновено са с плътност 2,5 х 105 клетки/мл в среда, състояща се от 70% замразена FBS, 20% базална (без антибиотици) DMEM-F12 и 10% DMSO в изопропанолова камера. 80 ° C за 24 часа и се премества в течната фаза на течния фризер N2 за дългосрочно съхранение.

    Адипогенна диференциация

    MSC успоредно на човешки костен мозък (фиг. 2АБ.) и PVAT производни клетки (Фигура 2Д.) са проведени проучвания. Левите панели на фигура 2 показват индуцирано състояние, при което не е очевидно натрупване на липиди. Правилните плочи показват клетки чрез адипоцитна диференциация и оцветяване на неутрални липиди с маслено червено О. Докато степента на диференциация в човешката аортна клапа е по-силна в клетките, получени от PVAT, и двата източника показват на човешката клетка способността да се диференцира в посока на адипогенната линия.

    Остеогенна диференциация

    Протоколът за остеогенна диференциация е приложен към MSC, получен от човешки костен мозък (Фиг. 3А-° С.) и PVAT-събрани клетки (Фигура 3D- F) се използва. Неиндуцирани клетки (фиг. 3АД.) не цапайте червено с ализарин. Съгласно протокола за остеогенна диференциация, човешкият MSC разработи калцирани възли, които бяха оцветени в червено с ализарин (Фиг. 3b- ° С), докато клетките, получени от човешка аортна PVAT, не го правят (Фигура 3Е-F.). Тези данни предполагат, че при подготовката ни на клетки от стромална съдова руптура на човешки PVAT липсват многобройни предци със способността да се подлагат на остеогенеза. В зависимост от проучването и времевия ход на диференциация, препоръчително е да се проследят стандартните петна с откриване на молекулярни маркери, които определят засягането на костнообразуващата линия (напр. RUNX2, Osterix, алкална фосфатаза) или остеобласти (остеопонтин, остеокалцин, алкална фосфатаза, BAP1).

    Хондрогенна диференциация

    Клетки от двата MSC на човешки костен мозък (Фиг. 4А) извлечен и човешки PVAT (Фигура 4b) показват характеристики, характерни за хондрогенната диференциация, с обилно натрупване на колаген в микромасата. Микромасите, образувани от човешки костен мозък MSC и клетки, получени от PVT на аортата, също показват изобилие от натрупвания на гликозаминогликани (синьо), както е показано чрез оцветяване в синьо Alcian (Фигура 4-Д., съответно). Морфологично структурите са подобни на пролуките със седене в кухини, създадени чрез отлагане на колаген (Фигура 4, Стрелки) околните клетки. В зависимост от проучването и времевия ход на диференциацията е полезно откриването на някои хондрогенни маркери (агрекан, колаген тип II, остеонектин, Sox9).

    човешки
    Фигура 1: Морфологични характеристики на човешкия PVAT. (А.) Карикатурно представяне на човешката аорта (червено) с околния PVAT (жълто). Стрелката показва възходящата аорта. (Б.) 480 mg парче PVAT на човешка аортна клапа от пациент с CABG в DMEM преди дисоциация. (° С.) Фиксирано от формалин на Masson парафиново вградено човешко PVAT трихромно оцветяване (тъмно кафяво/черно = ядра, синьо/лилаво = съединителна тъкан, розово = цитоплазма; имайте предвид, че червените кръвни клетки изглеждат червеникаво-розови.)Д.) Представителен образ на експлантираните PVAT стромални клетки за 7 дни в културата. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

    човешки
    Фигура 2: адипогенна диференциация. (А.) Фазовата микроскопия на човешкия костен мозък MSC в неиндуцирано състояние не показва данни за диференциация. (Б.) Фазовата микроскопия на човешки костен мозък MSC в индуцирано адипогенно състояние показва известна диференциация и обездвижване на неутрални липиди, оцветени с маслено червено О след 14 дни. (° С.) Фазовата микроскопия на човешки аортни клетки, получени от PVAT в неиндуцирано адипогенно състояние, не показва данни за диференциация. (Д.) Фазовата микроскопия на човешки аортни клетки, получени от PVAT, в индуцираното адипогенно състояние показва стабилна диференциация и обездвижване на неутрални липиди, оцветени с маслено червено О след 14 дни. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

    периваскуларни
    Фигура 4: Хондрогенна диференциация. (А, Б) Светлинна микроскопия на участък от микромаса, образуван от човешки костен мозък MSC (A) или човешки аортни клапи PVAT прогениторни клетки (B) в индуцирано хондрогенно състояние след 14 дни в култура и след това оцветени с Masson Trichrome, което предполага значително отлагане на колаген (синьо) и предполага успешна диференциация към хондрогенна линия. (C, D) Светлинна микроскопия на участък от Micromass, образуван от човешки костен мозък MSC (C) или прекурсори на PVAT на човешка аортна клапа (D) в индуцирано хондрогенно състояние след 14 дни в култура и след това оцветени в синьо с Alcian, което предполага отлагане на кисели протеогликани (напр. Б. гликозаминогликани), отколкото обикновено се намират в хрущялите. Контраст, ядрено червено бързо; Стрелки, структури, подобни на процепа. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Дискусия

    Стволовите клетки на мастната тъкан са се фокусирали върху приложенията на регенеративната медицина, благодарение на лесния достъп и големия брой клетки, които могат да бъдат получени от мастна тъкан 12, 13. Съдови клетки, възпалителни клетки, фибробласти, преадипоцити и стволови клетки от мастна тъкан се намират в съдовата част на стромалните клетки на мастната тъкан. Съществуват разлики в популацията на стволовите клетки въз основа на анатомичното местоположение на мастното депо и свойствата на адипоцитите 14. Най-важното е, че стволовите клетки, получени от мастна тъкан, изглежда могат да се диференцират не само в мезенхимни линии 15, но и потенциал да приемат невронни 16, 17 и епидермални 18 съдби.

    Многобройни проучвания са фокусирани върху стволови/прогениторни клетки, получени от човешка подкожна бяла мастна тъкан, но малко изследвания са разгледали характеристиките на потомствените популации на PVAT. Последните проучвания са изолирали адипоцитни родословни клетки от PVAT, обграждащи мезентериални съдове или гръдна аорта на плъхове. Докато тези CD34 +/CD140a + популации се диференцират в адипоцити, способността за изтегляне на други линии не е тествана 19 .

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Разкриване

    Авторите не са разкрили нищо.

    Благодарности

    Признаваме подкрепата на Навигационните изследвания в Медицински център в Мейн за съдействие при получаване на клинична тъкан и ядрото на хистопатологията и хистоморфометрията (подкрепено от 1P20GM121301, L. Liaw PI) в Изследователския институт за рязане и оцветяване в Мейн. Тази работа беше подкрепена от NIH Grant R01 HL141149 (L. Liaw).