Как да изберете етикет за вашия протеин

Сара Клинк

Дата на публикуване: 7/2019; tpub_215

Резюме

Маркирането на протеини е важен аспект на протеиновия анализ. Възможността да маркирате протеина си за различни приложения, включително пречистване, падащи анализи, имуноанализи и други, може да ви помогне да определите белтъчната функция. Но кой маркер трябва да изберете? Тази статия обхваща няколко опции за маркери и реагенти, базирани на афинитет или репортер, които могат да ви помогнат с експериментите.

Въведение

Протеините или полипептидите са неразделна част от клетъчната функция. Те са ензимите, които изграждат пътища за енергиен метаболизъм, клетъчен растеж, сигнализация, митотичен цикъл и клетъчна смърт. Възможността за изолиране и откриване на специфични протеини ни позволява да разберем кои протеини са част от по-големите комплекси, кои протеини взаимодействат и каква е тяхната роля в клетъчната функция и болестта. Един от начините да се изследва функцията на протеина е чрез добавяне на маркер към протеина, който представлява интерес, и отделянето му от клетъчния лизат за изследване на протеина.

Сливните тагове могат да бъдат полипептиди, малки протеини или ензими, добавени към амино (N) или карбокси (С) края на протеин. Маркирането може да се извърши чрез клониране във вектори или да се добави с помощта на CRISPR-Cas9 генно редактиране, за да се маркира ендогенен протеин. Използвайки афинитетен етикет, можете да изолирате или обездвижите протеин за допълнителни протеомни изследвания.

Докато изследователите обикновено маркират протеин, за да го пречистят от клетъчния лизат и използват изолирания протеин в биохимични анализи, пептидният маркер може да направи повече. Например, белтъци, маркирани с епитоп, могат да бъдат открити със специфично за етикет антитяло, ако няма антитела, специфични за вашия протеин. В допълнение, маркерите могат също така да определят количеството на протеините, да изучават протеиновите комплекси и да определят дали протеинът е вътре или извън клетката. Можете дори да визуализирате местоположението на протеина в клетката поради маркера на протеина.

И така, кой протеинов маркер е подходящ за вашите експерименти? По-долу е даден списък с опции за маркиране на протеини с инструменти, които могат да помогнат.

Полихистидини

Един от най-простите и малки етикети е полигистидиновият етикет или етикетът 6XHis. Обикновено този пептиден маркер се състои от шест хистидинови аминокиселини, които могат да бъдат поставени в N или C края на протеин. Поради малкия си размер, тагът His има тенденция да не променя структурата на протеин, което е полезно за анализи надолу по веригата. В допълнение, тагът His може да се свърже с метални йони като Ni 2+, Zn 2+ и Cu 2+, което го прави полезен за пречистване или обездвижване на слетите протеини.

Полихистидиновият маркер работи добре за бързо пречистване на протеини, експресирани в Е. coli, но за протеини, експресирани в клетки на бозайници или насекоми, по-големият брой остатъци от хистидин означава, че има по-високо свързване на фона. Следователно, за да се увеличи чистотата на протеините, металните смоли, които свързват маркираните с His протеини, трябва да бъдат строго измити. В допълнение, денатуриращи агенти като 8М урея или 6М гуанидин НС1 могат да се използват с маркирана с His мембрана или неразтворими протеини за подобряване на пречистването.

За да добавите маркера His към вашия протеин, клонирайте ORF във вектор, който носи маркера. В зависимост от използвания промотор, експресирайте маркирания протеин в бактериални, бозайникови или насекоми клетки. Като алтернатива можете да използвате безклетъчни експресионни системи за протеинова експресия. За пречистване на протеина можете да използвате магнитни топчета (напр. Система за пречистване на протеини MagneHis ™) или немагнитни смоли (напр. Система за пречистване на протеини HisLink ™) за клетъчни лизати. Ако вашият маркиран с His протеин се експресира в система, базирана на заешки ретикулоцитен лизат, системата за пречистване на протеини MagZ ™ е полезна за пречистване на протеини с минимален хемоглобин. След като се елуира от пречистващата матрица, маркираният ви протеин е готов за използване за по-нататъшно изследване.

Пречистване на протеини с полихистидин

протеин

Глутатион-S-трансфераза

Глутатион-S-трансферазата (GST) е афинитетен маркер, използван за протеини, експресирани в Е. coli за пречистване на маркираните протеини от бактериални лизати. Този 26kDa пептиден маркер е част от семейство цистолни протеини, присъстващи в еукариотите, което го прави по-малко полезен при опит за изолиране на протеини от еукариотни клетки поради конкуренция от други протеини. Маркирането на еукариотни протеини с GST повишава разтворимостта на слетия протеин, когато се изразява в бактерии. В допълнение, GST-маркираните протеини могат да се експресират на високи нива в бактериите, но могат да образуват тела на включване поради протеинова агрегация. GST тагът може да бъде добавен към N или C края на протеина от интерес.

GST има силен афинитет към глутатион, което означава, че можете да улавяте сливания на GST протеин върху имобилизирана матрица като мъниста, покрити с глутатион. Тази свързваща характеристика се използва за пречистване на протеини, както и за улавяне на протеини, които биха могли да се свържат с вашия протеин (напр. Тестове за сваляне).

Докато протеините с GST маркер могат да бъдат силно експресирани и по-разтворими, големият размер на маркера може да попречи на функцията на протеини в приложения надолу по веригата. Може да успеете да изцедите протеина си от GST маркера, намалявайки възможните функционални смущения. Ако експресираният протеин се е агрегирал в тяло на включване, афинитетно пречистване с помощта на глутатион става проблематично. GST трябва да бъде правилно сгънат, за да се свърже успешно с глутатиона и дори ако GST етикетът се повтори, вашият протеин, който представлява интерес, може да не е.

За да използвате GST таговете, започнете с клониране на кодиращата област за протеина, който представлява интерес, във вектор и експресирайте маркирания протеин в E coli. Използването на индуцируем промотор за контрол на експресията на целеви протеин може да помогне с протеини, които са токсични за бактериалните клетки. След като бактериалните клетки се лизират (например с помощта на FastBreak ™ клетъчен лизисен реагент), можете да пречистите GST-маркирания протеин с помощта на смола на основата на глутатион (напр. Система за пречистване на протеини MagneGST ™). В зависимост от използвания вектор за клониране, може да има място на разцепване на протеаза за премахване на GST маркера от вашия протеин. След като протеинът ви се елуира или разцепи, той е готов за анализ.

Пречистване на GST-протеинови сливания

Протеин HaloTag®

Докато GST и 6XHis маркерите са полезни за изолиране на протеини, експресирани в бактериални клетки, има опции за маркиране, които са съвместими както с E. coli, така и с клетки на бозайници. Протеинът 34kDa HaloTag® предлага гъвкавост на тази система за експресия. За разлика от други маркери, които използват нековалентни взаимодействия за пречистване на протеини, основата на технологията HaloTag® е ковалентното свързване между протеина HaloTag® и неговия лиганд. Поради силата на ковалентната връзка, можете да измиете маркирания си протеин при строги условия и основно да премахнете всякакъв неспецифичен протеинов фон. Притеснявате се от размера на маркера, засягащ функцията на протеина ви? Няма проблем! Просто използвайте TEV протеаза, за да отделите протеина си от HaloTag и пречистеният, немаркиран протеин е готов за използване при анализ надолу по веригата.

Едно от предизвикателствата при експресията на протеини в бактериалните клетки е разтворимостта. Eukaroytic протеините не са метилирани и им липсват други пост-транслационни модификации, когато се синтезират в Е. coli, което ги прави склонни към образуване на тела на включване. Сливните тагове като този на протеина HaloTag® могат да направят рекомбинантните протеини по-разтворими и дори да подобрят експресията в бактериите, правейки протеина, който ви интересува, да бъде по-лесен за пречистване. Чрез изразяване на вашето сливане с HaloTag-протеин в клетки на бозайници, ще бъдат налице посттранслационни модификации, отразяващи по-точно как протеинът ще функционира при клетъчни условия. Използвайки имобилизирана матрица като смола, покрита с лиганд HaloTag®, можете да пречиствате само протеини с присъстващ HaloTag или да използвате в падащи анализи за откриване на това кои протеини или протеини се свързват с вашия протеин, който ви интересува. По този начин можете по-добре да разберете протеиновите взаимодействия.

Но приложенията не спират с протеини: протеинови взаимодействия и пречистване на протеини. Ако искате да проучите каква ДНК последователност свързва вашият протеин, технологията HaloTag® може да ви помогне да дешифрирате взаимодействието протеин: ДНК. Какво да използвам имунохимия? Имаме антитяло за това. Интересувате ли се от клетъчни изображения? С вашия протеин, слят с протеин HaloTag® и флуоресцентни HaloTag® лиганди, можете да намерите къде е локализиран вашият протеин, дали е трафикиран и колко бързо се обръща. Има дори лиганди за микроскопия със супер разделителна способност и FACS. Научете повече за технологията HaloTag® тук.

За да започнете с технологията HaloTag®, клонирайте кодиращата област за протеина, който ви интересува, в традиционните или клониращи вектори на Flexi®, за да добавите HaloTag в N или C края. Като алтернатива можете да търсите някой от хилядите предварително изградени клонове HaloTag®, предлагани от Kazusa. След като имате своя клонинг, можете да го използвате за всяко приложение за анализ на протеини. В зависимост от това, което искате да направите по-нататък, може да се нуждаете от система за пречистване (напр. HaloTag® система за пречистване на протеини от бозайници или система за пречистване на протеини HaloTag®) или падащ анализ (напр. HaloTag® системи за изтегляне на бозайници). За образни изследвания ще трябва да изберете правилния флуоресцентен лиганд (напр. HaloTag® Ligands или Janelia Fluor® HaloTag® Ligands). Ако се интересувате от имунологични изследвания, Anti-HaloTag® pAb би помогнал. За протеинови взаимодействия има NanoBRET ™ PPI системи за протеини: проучвания за протеинови взаимодействия и HaloCHIP ™ система за изследване на протеин: ДНК взаимодействия.

Технология за взаимозаменяемо етикетиране HaloTag®

Фигура 1. Тази илюстрация показва как протеинът HaloTag® се слива с протеин от интерес и ковалентното свързване между HaloTag и неговия лиганд.

Докато повечето от пептидните маркери, обсъдени по-рано, са афинитетни маркери за използване при пречистване на протеини, падащи анализи или методи, които свързват маркирания протеин към твърда матрица, има и други видове маркери за различни приложения. От количествено определяне на протеини до ендогенно маркиране, биолуминесцентен маркер или дори малък репортерен протеин, слят с протеин, може да се използва за проследяване на маркиран протеин в клетката, премахвайки необходимостта от антитела.

HiBiT

По-малкият е по-добър за много неща, а малък пептиден етикет с 11 аминокиселини, наречен HiBiT, е чудесен за маркиране на протеин. Ако искате да пропуснете традиционното клониране, можете дори да използвате CRISPR генно редактиране, за да добавите HiBiT таговете към ендогенен протеин. Това има предимството да се изследва протеин без свръхекспресия, който обикновено се наблюдава при използване на екзогенна експресия от плазмид. Като поддържате клетъчните протеини в същите пропорции, които се намират в клетката, вие сте в състояние да изучавате промените във вашия маркиран протеин при физиологични условия. Това предимство означава по-малко артефакти от свръхекспресия на протеини и по-биологично значими резултати. Протоколът CRISPR за добавяне на пептиден маркер е прост и с малки размери, ако HiBiT предлага висока ефективност на редактиране.

HiBiT сам по себе си не е биолуминесцентен. След като обаче се добави реагент за откриване, който съдържа комплементарния протеин LgBiT, се получава ярък луминесцентен сигнал. Количествено измеримият сигнал е лесен за измерване с помощта на луминометър. Биолуминесцентните анализи са чувствителни и предлагат откриване до наномоларни нива. Искате ли да изследвате извънклетъчни или секретирани протеини? Имаме система за реактиви за това! Комбинирайте количественото определяне на общия белязан протеин с нашата литична система и изследвайте нивата на секретиран протеин, използвайки нашата извънклетъчна система.Можете дори да премахнете нуждата от антитяло и да използвате нашата биолуминесцентна блотираща система за откриване на протеини, попити до мембраната. Ако LgBiT се експресира вътреклетъчно, можете кинетично да откриете изобилие на протеин, маркирано с HiBiT, в живи клетки. Вижте тук как можете да използвате HiBiT за маркиране на протеини.

За да започнете да използвате HiBiT, можете да клонирате вашия ORF в един от традиционните вектори на MCS или Flexi® или да използвате метод CRISPR, за да добавите маркера към геномната последователност. Поставете маркера там, където е необходимо за оптимално откриване. След като протеинът ви бъде маркиран с HiBiT, определете кой метод работи най-добре за вашите проучвания (Nano-Glo® HiBiT Lytic, вътреклетъчни или блотинг системи).

Преглед на системата за литично откриване Nano-Glo® HiBiT

NanoLuc® луцифераза

Понякога само репортер ще го направи. За щастие, луциферазата NanoLuc® е 19kDa ензим, което прави биолуминесцентния протеин достатъчно малък, за да се придвижва с друг протеин, без да пречи на нормалните клетъчни функции. Подобно на HiBiT, NanoLuc осигурява чувствителен, лесно количествено определен белтък за сливане на протеини. Репортерният ензим обаче не изисква партньор за допълване, което опростява използването му в някои приложения. Яркостта и малкият размер означава, че луциферазата NanoLuc® може да се побере във вирусни частици, без да създава затруднения. Прочетете как са го направили тези изследователи по вирусология. Като репортерен ензим, NanoLuc® луциферазата може да помогне за откриване на клетъчното местоположение на слят протеин, както и за проследяване на пътя, който вашият протеин може да поеме. В допълнение, синтетичните протеини NanoLuc® могат да бъдат използвани в приложения на биолуминесцентния резонансен трансфер на енергия (BRET) за изучаване на протеини: протеинови взаимодействия или ангажиране с малки молекули. Научете повече за възможностите на този репортерен ензим.

За да създадете протеиново сливане с NanoLuc® луцифераза, ще трябва да клонирате ORF в NanoLuc® репортерен вектор, като поставите NanoLuc на N или C край. В зависимост от вашето приложение можете да използвате система за литично откриване (напр. Nano-Glo® Luciferase Assay System) или тест за откриване на живи клетки (напр. Nano-Glo® Live Cell Assay System).

Обобщение

Изборът на маркер за вашия протеин се основава на вашите експериментални нужди. Независимо дали имате нужда от афинитетен маркер за пречистване на протеини, искате да създадете единичен фузионен протеин, който да се използва в различни методи за анализ на протеини, или да добавите ендогенен маркер, използвайки CRISPR-Cas9 генна редакция, има набор от маркери и репортерни ензими.