Изследвания за синтез и структура на мутагенност на заместени ароматни амини
Изследвания за синтез и структурна мутагенност на заместени ароматни амини и итро съединения нови стратегии за намаляване на мутагенността O 2 R R H 2 Markus Klein
Проучвания за синтез и структурна мутагенност на заместени ароматни амини и итро съединения Нови стратегии за намаляване на мутагенността Дисертация за получаване на докторска степен по природни науки (д-р Ред. Нар.) Към Катедрата по химия в Университета на Филипс в Марбург, представена от Маркус Клайн от Гронау Марбург/Лан 2
Части от тази работа вече са публикувани: M. Klein, G. Boche (1999) Региоспецифичен синтез на заместени нитрофлуорени и аминофлуорени с реакция на свързване на egishi като ключов етап, Synthesis 7, 1246-125. M. Klein, U. Voigtmann, T. Haack, L. Erdinger, G. Boche (2) От мутагенни до немутагенни нитроарени: Ефект на обемисти алкилови заместители върху мутагенната активност на 4-нитробифенил в Salmonella thyphimurium. Част I. Заместители, орто на нитро групата и в 2'-позиция, Mut. Резолюция 467, 55-68. M. Klein, L. Erdinger, G. Boche (2) От мутагенни до немутагенни нитроарени: Ефект на обемисти алкилови заместители върху мутагенната активност на нитроароматичните вещества в Salmonella thyphimurium. Част II Заместители далеч от нитро групата, Mut. Резолюция 467, 69-82. Приет като дисертация от Катедрата по химия на Университета Филипс в Марбург на: 26.6.2 Първи рецензент: Втори рецензент: проф. Д-р Г. Боче проф. Д-р T. Carell Ден на устния изпит: 5.7.2
Велики са делата Господни; който го изследва, му се радва. Псалм 111, 2
Съдържание I.2 Синтези и експерименти 27 I.2.1 Оборудване, химикали, методи. 27 I.2.2 4-итробифенили и 4-аминобифенили с алкил и CF 3 заместители. 21 I.2.3 4-итробифенили и 4-аминобифенили с хидрокси/алкокси заместители. 22 I.2.4 4-итробифенили и 4-аминобифенили с диалкиламино заместители. 233 I.2.5 Други 4-итробифенили и 4-аминобифенили. 238 I.2.6 2-итрофлуорен и 2-аминофлуорен. 241 I.2.7 Хетероароматни съединения. 25 I.2.8 4-итростилбен. 257 I.3 Изследвания на мутагенността 26 J Библиография. 261 III
Списък на съкращенията Фиг. Ad AIB Arom ATP AcCo A dba CYP d DC DCC DCM DME DMF dppe dppf dppp EE EtOH h IF HMPTA HMDS MO BS PAH PAPS PE PPA Py QSAR THF TAV TBABr 3 TPPTS TFP UDP Фигура Адамантил азобис-изобубутронитритрилат ацетил коензим А дибензилиденацетон цитохром Р дни тънкослойна хроматография дициклохексилкарбодиимид дихлорометан диметоксиетан диметилформамид 1,2-бис (дифенилфосфино) етан 1,1-бис (дифенилфосфино) фероцен 1,3-бис (дифенилфосфино) фероцен 1,3-бис (diphenylphosphinosacidametramoxyno-бензоена киселина етилов ацетат (дифенилфосфино) ethoxyacetylametroxyno (дифенилфосфино) етил ацетат (дифенилфосфино киселина етил ацетат) (дифенилфосфино киселина етил ацетат) (дифенилфосфино киселина етил ацетат) (дифенилфосфино киселина етил ацетат) (дифенилфосфино киселина етил ацетат) Полицикличен ароматен 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосулфатен петролен етер (4-6 C) полифосфорна киселина пиридин Количествена структура взаимодействие активност тетрахидрофуран Типични инструкции за работа Тетрабутиламониев трибромид тринатриев 3,3 ', 3' '- фосфантриилфентрисулфурилбензилсулфат
Въведение A.3 Цели и структура на тази работа Сред многото мутагенни и канцерогенни вещества ароматните амини и итроароматиците са от огромно значение. Многобройни представители на тези класове вещества се произвеждат и прилагат в голям мащаб в промишлеността, но те също се образуват по време на горивни процеси (дизел, пушене и др.) Или когато месото се нагрява и поради това са широко разпространени в околната среда. Високият канцерогенен потенциал на такива съединения е най-вероятно отчасти отговорен за постоянното нарастване на рака в индустриализираните страни. Поради техния механизъм на действие, те са генотоксични и трябва да бъдат метаболитно активирани (вж. Глава Б), особено при амино и итроароматичните вещества, има висока корелация между канцерогенността и мутагенността. Промишлената употреба на тези вещества представлява потенциално висок риск за човешкото здраве и поради това е все по-ограничена от закона. Ракът на пикочния мехур, причинен от ароматни амини, е признато професионално заболяване, което е било засегнато през последните 2 години
8 работници са загинали. 14 Следователно индустрията се призовава да разработи по-безопасни заместители. Точно в този момент започва настоящата работа. По какъв начин ароматните амини и ироароматичните вещества трябва да бъдат модифицирани, за да се намали техният мутагенен потенциал и по този начин техните канцерогенни свойства или дори да се изгасят напълно? Използвайки моделни вещества, получени от известни канцерогени като 4-итробифенил 1, 4-аминобифенил 2, 2-итрофлуорен 3, 2-аминофлуорен 4 и 4-итростилбен 5, ние изследваме как структурните промени са резултат от модификация на функционалната група, но преди всичко чрез въвеждане на различни заместители (напр. алкил, CF3, алкокси или диалкиламино групи) върху мутагенността на основните тела. Фиг. 2: Как структурните модификации влияят на мутагенността? O 2 O 2 O 2 1 3 5 H 2 H 2 2 4 8
Ароматни амини и итро съединения образуват напр. тъй като определени базови последователности се срещат там по-често - по-силен канцерогенен потенциал от тези, които реагират по-малко специфично. В случай на ариламини като 2-аминофлуорен или 4-аминобифенил, например, образуването на чернодробни тумори може да бъде корелирано с GT трансверсии в първата база на кодон 61 в ras прото-онкоген i. 56 Дори след образуването на адукта структурата продължава да играе важна роля. 4-аминобифенил и 2-аминофлуорен реагират, за да образуват сравними адукти в черния дроб на мишката, но DA адуктите на 2-аминофлуорена (например - (дезоксигуанозин-8-ил) -2-аминофлуорен 5) индуцират два пъти повече тумори от съответните адукти на 4-аминобифенил (например - (дезоксигуанозин-8-ил) -4-аминобифенил 41). 57 Тестовете за мутагенност на редица амини и итроароматици в Salmonella typhimurium TA1538 разкриват подобни ефекти (вж. Глава В). При сравняване на индукцията на мутации от образуваните дезоксигуанозинови адукти, бяха открити значителни разлики по отношение на ефективността: -ацетилбензидин> 1-итропирен
Тестът за мутагенност на Ames се използва за определяне на специфичността на мутацията. 7 От това може да се установи кои основи са атакувани от крайния канцероген и кой тип основни заместителни мутации се индуцират от мутагените. Такива изследвания са много по-лесни за провеждане от класическите методи за анализ на адукти. В сравнение със стандартните тестови щамове TA98 и TA1 и някои от техните варианти (TA98R, TA98/1.8DP 6), новите специални щамове досега са били използвани само в сравнително малко проучвания и сравненията са едва ли възможни. Преглед на последните постижения в развитието на нови щамове на Ames е предоставен от Josephy. 71 В тази работа са използвани стандартните тестови щамове TA1 и TA98 със и без метаболитно активиране. Някои вещества също бяха изследвани с TA98R. В.3 Прилагане За да осигури възможно най-висока възпроизводимост на резултатите от теста, Ames разработи стандартизирана работна процедура, която е описана накратко по-долу. Изискващите хистидин бактериални щамове (his-) се култивират в продължение на няколко часа в хранителен разтвор до определена клетъчна плътност (
Връзки структура-мутагенност Фиг. 17: Влияние на положението на функционалната група върху мутагенността H 2 H 2 2 65 TA98 + S9: 79 1,5 Rev/nmol 6) Хидрофобността може да проникне по-слабо в бактериалните стени. 39
Връзките между структурата и мутагенността, химически синтезирани хидроксиламини 79 и 81, като 77 и 39, са мощни мутагени. Очевидно е, че последващите етапи - т.е. естерификацията на OH групата и реакцията с DA - са далеч по-малко податливи на стерични фактори. Фигура 21: Причини за неактивност на 1-афтиламин и 2-аминобифенил H 2 HOH H 2 P 45 HOH 6 77 78 79 мутагенен мутагенен не мутагенен мутагенен H 2 HOH H 2 HOH P 45 2 39 8 81 мутагенен мутагенен не мутагенен мутагенен A Друга структурна характеристика, която е качествено корелирана с мутагенния потенциал и може най-добре да се интерпретира като стерично явление, е степента на ароматност на веществото и свързаната с него планарност. След Хираяма, 2-итропирен 82 е значително по-активен в TA98, отколкото в TA1 и по този начин действа предимно като мутаген на рамково изместване. 95 Фигура 22: Влияние на планарността върху мутагенността (TA98) ii 82 83 TA98-S9: 2569 Rev/nmol 37.7 Rev/nmol Чрез поетапно хидрогениране на страничните двойни връзки до 2-итро-4,5-дихидропирен и по-нататък до 2- итро-4,5,9,1-тетрахидропирен 83 отива планарност и в същото време също i Тук се получава само пръстенно окисление. ii Геометрията на структурите е оптимизирана с Chem3D, използвайки метода AM1. 41
Връзки между структура и мутагенност '3' -O 4-хидроксиламинобифенил 4HOHBp 9 -HOH, -диметил-4-аминобифенил, -DiMe-4ABp 91 -Me 2-tert-бутил-4-аминобифенил-tbu-4abp 92 -HtBu -ацетил-4-аминобифенил Ac-4ABp 93 -HOAc 3 2-I 4-итробифенил 4 4Bp 1 2 O 2 -H 4'-метил-4-нитробифенил 4'Me-4Bp 94 1 '-Me 4'-етил-4-нитробифенил 4'Et -4Bp 95 R 4 '1 2' 3 '-Et 4'-изо-пропил-4-нитробифенил 4'iPr-4Bp 96 -ipr 4'-терт-бутил-4-нитробифенил 4'tBu-4Bp 97 -tbu 4 '-n-бутил-4-нитробифенил 4'nBu-4Bp 98-nbu 3 2-II 3'-метил-4-нитробифенил 3-Me-4Bp 4 99 O 2 -H/-Me R 3', 5'- Диметил-4-нитробифенил 3 ', 5'DiMe-4Bp 1 1' -Me 3 ', 5'-ди-терт-бутил-4-нитробифенил 3', 5'DitBu-4Bp 11 2 1 4 '2' 3 ' R-tbu 4 2-III 4'-Адамантил-4-нитробифенил O 4'Ad-4Bp 12 2 -Ad 4-итротерфенилен 4 '4Tp 13 -Ph 2-Phenyl-5-nitropyridine 2Ph5P 2 14 -H 4'-tert -Бутил-2 -фенил-5-нитропиридин 4'tBu-2Ph5P 15 R 4 '5 O 2 R -tbu 3 2-итро-5-фенилпиридин 4 5Ph2P 16 O 2 -H 4'-трет-бутил-2-нитро-5-фенилпиридин 4'tBu-5Ph2P 17 5 1 'R 4' 2 '3' 2-VI 2-итрофлуорен 2F 3 7 2 -H 2 -tbu 7-метил-2-нитрофлуорен 7Me-2F 18-Me 7-tert-бутил- 2-нитрофлуорен 7tBu-2F 19 -tbu 7-адамантил-2-нитрофлуорен 7Ad-2F 11 -Ad RO 2 5
Синтез на моделните вещества Таблица 9: Резултати от кръстосаните съединения с CF 3-заместени 4-итробифенили F Метод на въвеждане Продукт 3 C O 2 Добив b 1 Suzuki a 4'CF 3-4Bp 126
Хидроксиламино> амино> итро от. Диметилирането на аминофункцията само леко намалява мутагенността в сравнение със свободния амин, тъй като метиловите групи лесно се разделят чрез окисление. Терт-бутилирането или ацетилирането на аминогрупата води до по-малко мутагенни съединения (92, 93), но този ефект не е достатъчен за пълно потискане на мутагенността. 14-ти
Резултати и обсъждане на изследванията за мутагенност F.2.1.2 По-големи алкилови заместители Дали такова намаляване на мутагенността може да бъде пренесено и в други системи с орто-алкилови групи и по този начин общо валидна връзка структура-мутагенност е разгледана подробно в нашата работна група. Schmitt има 1-алкил-2-аминонафталени (1-алкил-2А) 6, 38-311, 1-алкил-2-аминофлуорените (1-алкил-AF) 4, 312-315 и 3-алкил-4-аминобифенилите ( 3Alkil-4ABp) 2, 316-319 синтезирани и проведени тестове на Ames. 26 Съответните изследвания на 3,5-диалкил-4-аминобифенилите 32-322 (3,5DiAlkyl-4ABp) са от Glende 151 (Таблица 26). За сравнителен анализ мутагенният потенциал в ревертантите/(1 nmol) отново беше изчислен въз основа на вашите данни чрез регресионен анализ съгласно метода, описан в C.5. Показани са само данни, получени в присъствието на S9-Mix, тъй като повечето амини са неактивни без S9-Mix, както се очаква. Фигура 82: Орто-алкилирани 2-аминонафталени, 2-аминофлуорени и 4-аминобифенили Et ipr nbu tbu H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 6 38 39 31 311 Et ipr nbu tbu H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 4 312 313 314 315 H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 Et ipr nbu tbu 2 316 317 318 319 Me H 2 Et H 2 ipr H 2 Me Et ipr 32 321 322 18
Резултати и обсъждане на проучванията за мутагенност Таблица 27: Преглед на мутагенността на орто-алкилирани 4-итробифенили Съединение F.2.1.3 Ревертанти/(1 nmol) TA98-S9 TA98 + S9 TA1-S9 TA1 + S9 4Bp 1 8.53-1.31- 3Me-4Bp 323 4.64-24.3-3Et-4Bp 324.51-13.71-3iPr-4Bp 325.43-4.12-3tBu-4Bp 326 69). Такива итро разположения са известни от кристални структури на орто-алкилирани итро съединения. 112
1% Ако структурата на основното тяло вече има толкова ясно влияние върху съотношението на DA конформациите, може да се приеме, че заместители, които променят формата на молекулата, също имат подобно влияние. Особено с адукти с големи 134
Резултати и обсъждане на проучванията за мутагенност, когато репликацията води до по-малко или може би дори без мутации, съединения като 4ABp 2 и 4'tBu-4ABp 116 трябва да бъдат значително по-малко мутагенни от равнинните молекули като 2AF 4. Стерично взискателните заместители (трет-бутил, адамантил) също могат да нарушат динамичната трансформация на конформациите чрез увеличаване на енергията на активиране за този процес чрез неблагоприятни стерични взаимодействия. 141