Изследване на ензима на амилаза
Реакциите на хидролитично разцепване на нишестени молекули протичат с участието на специални ензими.
Сложните въглехидрати на храната, постъпващи в човешкото тяло, имат различна структура от въглехидратите в човешкото тяло. Така че полизахаридите, съставляващи растително нишесте, амилоза и амилопектин, са линейни или слабо разклонени глюкозни полимери, а нишестето на човешкото тяло, гликоген, на базата на същите глюкозни остатъци, образува различна, силно разклонена, полимерна структура от тях. Следователно асимилацията на хранителни олиго- и полизахариди започва с тяхното хидролитично разграждане по време на храносмилането до монозахариди.
Хидролитичното разграждане на въглехидратите по време на храносмилането става под действието на гликозидазни ензими, които разграждат 1-4 и 1-6 гликозидни връзки в сложни въглехидратни молекули.
Гликозидазите включват амилаза на слюнката, панкреатични и чревни сокове, малтоза на слюнка и чревен сок, крайна декстриназа, захараза и лактаза на чревния сок. Гликозидазите са активни в слабо алкална среда и се инхибират в кисела среда.
Разграждането на нишестето (и гликогена) започва в устата под действието на слюнчената амилаза. Слюнката е сложна биологична течност, участваща в поддържането на хомеостазата в устната кухина. В устната кухина няма чиста тайна на слюнчените жлези, а така наречената смесена слюнка или устната течност. Това е пълната тайна на всички слюнчени жлези, включва също микрофлора, съдържанието на денталните джобове, гингивалната течност, левкоцитите, остатъците от храна.
Слюнката съдържа протеини: амилаза, лизозим, албумин, глобулини и муцин. Ензимът амилаза в слюнката може да превърне полизахаридното нишесте в дизахаридна малтоза.
Съдържанието на амилаза в слюнката варира от човек на човек; следователно усвояването на едно и също количество нишесте със слюнка отнема различно време за различните хора.
Реактиви и оборудване: 1% разтвор на нишесте, слюнка, разтвор на Лугол, епруветки, филтри, филтърни фунии, спиртна лампа, кибрит, държач на епруветка, термостат, пипети.
Изсипете 10 ml 1% разтвор на нишесте в 2 епруветки, добавете 2 ml филтрирана слюнка към първата и 2 ml филтрирана и предварително сварена слюнка към втората. Поставяме двете епруветки в термостат при 38-40 ° C. Всяка минута вземаме 1-2 ml течност от епруветките, охлаждаме сместа, добавяме 1-2 капки разтвор на Lugol.
Наблюдения. Пробите от една епруветка първо са сини, след това червени, а следващите са жълтеникави. Под действието на ά-амилаза по време на хидролитичното разлагане на нишестето се образуват декстрини (С6Н10О5) n с различна сложност, които дават различно оцветяване с йод:
Схема за хидролиза на нишесте
Амилодекстрин → еритродекстрин → синьо оцветяване в червено
→ ά-ахродекстрин → γ-ахродекстрин → малтодекстрин → малтоза не дават специфично оцветяване, имат жълтеникав цвят
Когато йод се добавя към проби, взети от 2 епруветки, винаги се наблюдава син цвят на разтвора.
3. 2. Определяне на активността на амилазата съгласно Wolgemuth
Методът се основава на определянето на най-малкото количество амилаза (при максимално разреждане на слюнката), което напълно разгражда цялото добавено нишесте.
Амилазната активност на слюнката се изразява чрез обема (в ml) на 0,1% разтвор на нишесте, който разгражда 1 ml неразредена слюнка при 38 ° C за 30 минути. Нормалната активност на слюнката е 160-320 единици.
Този метод не изисква специално оборудване (FEK, спектрофотометър).
Реактиви и оборудване: слюнка, дестилирана вода, 1% разтвор на нишесте, 1% разтвор на йод, стъклена пръчка, 10 епруветки, термостат.
Изсипете 1 ml вода в 10 епруветки и към първата от тях добавете 1 ml слюнка, разредена 10 пъти. Смесваме съдържанието на тази епруветка и прехвърляме 1 ml от сместа във втората епруветка. Също така смесваме съдържанието на втората епруветка, прехвърляме 1 ml от сместа в третата епруветка и продължаваме по този начин до 10-тата епруветка. Изсипете 1 ml от сместа от десетата епруветка.
Добавете 1 ml вода и 2 ml 0,1% разтвор на нишесте към всички епруветки, смесете съдържанието, разклатете епруветките и ги поставете в термостат при 38 ° C за 30 минути. След инкубация епруветките се охлаждат със студена вода, добавя се към тях 1 капка 0,1% разтвор на йод и се разбърква. Слюнчената амилаза (EC 3.2.1.1) катализира реакцията:
(С6Н10О5) n + nH2O → декстрини → С12Н22О11
При взаимодействие с йод течността в епруветките става жълта (малтоза), оранжева (ахродекстрини), червена (еритродекстрини), лилава (амилодекстрини) и синя (нишесте) цветове.
Въвеждаме получените данни в таблицата.
Тръба № 1 2 3 4 5 6 7
в) 3 проби Светло жълто жълто. Международна -жълто. Оранжево. Червен. -кафяво Виолетово.
Маркираме последната епруветка с жълт цвят, в който нишестената хидролиза е преминала напълно, и правим изчисленията.
а) слюнка на пушач преди обяд - епруветка № 4. Тази епруветка съдържа 1/160 ml неразредена слюнка.
1/160 ml слюнка разгражда 2 ml 0,1% разтвор на нишесте,
1 ml слюнка разгражда Hml 0,1% разтвор на нишесте,
Следователно 1 ml неразредена слюнка разгражда 320 ml 0,1% разтвор на нишесте за 30 минути при 38 ° C. Записваме активността на слюнчената амилаза, както следва:
A (38 ° C/30 минути) = 320 единици.
б) слюнка на непушач преди обяд - епруветка № 6. Тази епруветка съдържа 1/640 ml неразредена слюнка.
1/640 ml слюнка разгражда 2 ml 0,1-разтвор нишесте,
1 ml слюнка разгражда Hml 0,1% разтвор на нишесте
X = 1280, A (38 ° C/30 минути) = 1280 единици.
в) слюнка на пушач след вечеря - епруветка № 5. Тази епруветка съдържа 1/320 ml неразредена слюнка.
1/320 ml слюнка разгражда 2 ml 0,1% разтвор на нишесте,
1 ml слюнка разгражда Hml 0,1% разтвор на нишесте,
X = 640, A (38 ° C/30 минути) = 640 единици.
г) слюнка на непушач след обяд - епруветка № 7. Тази епруветка съдържа 1/1280 ml неразредена слюнка.
1/1280ml слюнка разгражда 2ml 0,1% разтвор на нишесте,
1 ml слюнка разгражда Hml 0,1% разтвор на нишесте,
X = 2560, A (38 ° C/30min) = 2560 единици.
3. Изследване на ефекта на амилазата при хора и животни върху нишестето
Слюнката ще служи като източник на човешка амилаза. Ще открием амилази от животински произход в пчелния мед.
Реактиви и оборудване: слюнка, пчелен мед, вода, течна нишестена паста, йодна тинктура, разтвор на сода за хляб, оцет, епруветки, пипети, стъклени пръчици.
Нека подготвим 5 решения. Първото решение: събира се в епруветка около 0,5 ml слюнка и се разрежда със студена преварена вода 20 пъти. Второ решение: много течна нишестена паста (четвърт чаена лъжичка нишесте в чаша вода). Трето решение: фармацевтична йодна тинктура, разредена с вода 20 пъти. Четвъртото решение: 2-3 капки пчелен мед, разредени 10 пъти с вода и добре разбъркани. Пето решение: половин чаена лъжичка сода за хляб в 10 супени лъжици вода.
За изследването вземаме 9 епруветки, изсипваме около 5 мл паста във всичко. Добавете 5 капки оцет към епруветки 1, 4 и 7 с пипета и същото количество содов разтвор към епруветки 2.5 и 8. Добавете 5 капки чиста вода към останалите епруветки. Смесете съдържанието на епруветките и добавете 10 капки разредена слюнка към всяка. След 10 минути добавете 1-2 капки йоден разтвор към епруветки 1, 2 и 3 и сместа смесете. Наблюдавайте промяната на цвета.
След още 15 минути добавете същата порция йод към епруветки 4, 5 и 6 и след още 10 минути към останалите епруветки. Нишестето и декстрините дават различни цветове с йод и тъй като нишестето се разрушава от амилаза, цветът се променя. Така че можете да прецените не само за разграждането на нишестето, но и за това коя среда - кисела, неутрална или алкална - е по-благоприятна за този процес.
По същия начин зададохме експеримента с пчелен мед.
4. Ензимна хидролиза на нишесте
Предварително пригответе ензимни препарати от препарати- и β-амилази.
Реактиви и оборудване: семена от ечемик, дестилирана вода, оцет, креда на прах, разтвор на нишесте, йоден разтвор, хоросан, порцеланов пестик, дебел плат, стъкло, водна баня, 10 епруветки, пипета.
Смеляваме развиващите се ечемичени семена в хаванче, разреждаме кашата с двойно количество дестилирана вода и я изстискваме през плътна кърпа в чаша. Този екстракт съдържа два ензима: алфа-амилаза и бета-амилаза. Допълнителната обработка може да унищожи единия от тях, за да се наблюдава действието на другия.
Ние унищожаваме алфа-амилазата чрез нагряване. Сместа се добавя към една част от екстракта от ечемик и се загрява за 20 минути на водна баня при 70 ° C, като се разбърква старателно. Охладеният разтвор съдържа бета-амилаза.
За да получите разтвор на алфа-амилаза, трябва да разградите бета-амилазата с киселина. Охладете около 5 ml от екстракта до 2-3 ° C в хладилника, добавете непълна чаена лъжичка охладен оцет и добавете студена вода почти до върха на епруветката. Разбъркайте сместа и оставете за 15-20 минути и след това неутрализирайте разтвора, като добавите креда на прах, докато мехурчетата спрат. Разбъркайте отново сместа, разредете я 2 пъти с вода, оставете я да се утаи и отцедете течността върху утайката в чиста епруветка. Това завършва подготовката за експеримента.
Изсипете 1 ml разтвор на нишесте и 9 ml вода в 10 епруветки. Добавете 10 капки разтвор на алфа-амилаза с пипета към епруветки 1-5 и същото количество разтвор на бета-амилаза към останалите епруветки. Смесете съдържанието на всички епруветки. След 3 минути добавете 1 капка йоден разтвор към епруветки 1 и 6 и разбъркайте. Правим същото с епруветки 2 и 7 след 5 минути, 3 и 8 - след 10 минути, 4 и 9 - след 20 минути, 5 и 10 - след 30 минути.
Наблюдения: под действието на алфа-амилазата нишестето се разгражда на декстрини, за което съдим по образуването на характерна гама от цветове: лилав, червено-кафяв, червен, оранжев, жълт. В присъствието на ά-амилаза цветът се променя бързо.
В присъствието на бета-амилаза декстрините не се образуват, във всички епруветки се наблюдава син цвят, чийто интензитет намалява с разпадането на нишестето. Бета-амилазата „отхапва“ парчета молекули на нишесте.
Резултатите от този експеримент ясно показват разнообразието от свойства дори за подобни ензими.
Въз основа на извършената работа могат да се направят следните заключения:
1. Тестът слюнка съдържа алфа-амилаза. Когато слюнката се вари, алфа-амилазата се разгражда и нишестето не се разгражда.
2. Амилазната активност на непушача е по-висока от тази на пушача. Заклетите пушачи имат много малко амилаза в слюнката си.
3. Нишестето и декстрините дават различни цветове с йод и тъй като нишестето се разрушава от амилаза, цветът се променя. Оптималното действие на амилазата е в рамките на неутралната реакция.
4. ά- и β-амилазите имат различен характер на действие. В живите организми ензимите обикновено работят заедно.
Слюнката е отличен обект за биохимични изследвания и освен това, за разлика от повечето други обекти от животински произход, тя е постоянно достъпна.
Биохимията е една от най-интересните и практически значими науки. Експериментът в този курс играе ролята на източник на знания за веществата, които изграждат живите организми и техните трансформации. Трансформациите, които се случват в този случай, са много по-сложни от тези относително прости реакции, които наблюдаваме в епруветките. Но познаването на простото е първата стъпка към познаването на сложното.
Изследването на себе си, собствената си слюнка, носи допълнителен интерес към тази експериментална работа. Всъщност е интересно да се установи, че в устната ви кухина работи биокаталитична система.
Данните, получени по време на експеримента, могат да бъдат използвани при изучаването на някои раздели на биологията (теми "Храносмилане. Храносмилателни ензими") и химията ("Въглехидрати. Метаболизъм на въглехидратите").