Изолиране и диференциация на получените от мастна тъкан стволови клетки от свински подкожни мастни клетки

Въведение

Затлъстяването, което представлява приблизително 30% от населението на САЩ, с индекс на телесна маса над 30, се очертава като световен феномен 1. Затлъстяването 2-4 води до усложнения, свързани със сърдечно-съдови заболявания, диабет тип 2 и рак. Следователно със затлъстяването може да се справим е важен приоритет. Затлъстяването се проявява чрез масивно разширяване на мастната тъкан и се дължи на преяждането и заседналия начин на живот в съвременното общество. По този начин, провеждането на транскрипционна регулация на адипогенезата и дешифрирането на липогенезата може да обещае лечение на затлъстяване или диабет.

3T3-L1, 3T3-F442A и други миши адипогенни клетъчни линии са приложени за изследване на адипогенезата или липогенезата по време на развитието на мастната тъкан. Съществуват обаче някои отклонения в регулаторните механизми между клетъчните линии in vitro и in vivo животински 6. Първичните мастни клетки, получени от мастна тъкан (ADSC) във фракцията на съдовите клетки на стромата, могат да бъдат изолирани директно от бялата мастна тъкан и да бъдат индуцирани да се диференцират. Диференциацията на ADSC в адипоцитите най-вероятно рекапитулира процеса на адипогенеза и липогенеза в развитието на мастната тъкан in vivo 7.

Прасетата са подходящ животински модел за изследване на адипогенезата и липогенезата в развитието на мастната тъкан. Нашите предишни проучвания свинско 8-10 показват, че експресията на стерол - регулаторен елемент, свързващ транскрипционен фактор 1c (SREBP1c), важен транскрипционен фактор, за който е известно, че модулира транскрипционната липогенна мастна киселина синтаза, която се инхибира от полиненаситени мастни киселини (PUFA) в свинския черен дроб и мастната тъкан . Експресията на свинския SREBP1c намалява с PUFA in vivo и in vitro е подобна на други видове като човек и мишка 11-13. Тези проучвания при свине in vitro са основно в диференцирани адипоцити, получени от свински ADSC (pADSC). Следователно, тази първична клетъчна култура pADSC може да се използва като надеждна клетъчна система, която да служи за развитие на мастна тъкан или за изследване на други приложения на стволови клетки.

Протокол

ЗАБЕЛЕЖКА: Този метод е произведен и използван в изследвания, докладвани преди 14-17 от тази лаборатория; с течение на времето методологията се е променила. Настоящата процедура е направена от прасенце (на възраст от 7 до 9 дни) със засяване върху 6-ямкови плаки за тъканна култура със средно 60 g подкожна мастна тъкан от свине. Всички процедури бяха проведени при RT, освен ако не е посочено друго. Всички експерименти с животни са одобрени от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните (IACUC) към Националния университет в Тайван.

1. Пригответе храносмилателна среда

  1. Набавете подкожна мазнина от врата и гърба; 40 до 80 g на прасенце (на възраст от 7 до 9 дни), в зависимост от размера на прасетата. Тук използвайте 60 g подкожна мастна тъкан, получена от прасе.
  2. Пригответе храносмилателна среда: претеглете колагеназа II на прах с общо 54 000 единици и го разтворете в 90 ml Dulbecco-модифицирана среда Eagle (DMEM, 60 g мазнина) в 100 ml серологична бутилка (900 единици колагеназа/1,5 ml DMEM/g мазнина ).
  3. Внимателно се завърта за стерилизация, за да се разтвори най-малко 15 минути и след това преминава храносмилателната среда през 0,22 µm филтър, за да премине храносмилателната среда върху разклащаща маса (100 rpm). Съхранявайте при 4 ° C преди употреба.

2. Дисектирайте подкожната мастна тъкан от свинята

мастна
Фигура 1. Персонализирана машина за рязане за на Изолиране на използвания pADSC. Разчленена мастна тъкан от подкожна мастна тъкан от свински кръст, съставена от мастния слой с прикрепени кожни слоеве. За рязане на мастния слой с дебелина около 1 мм е необходима машина за рязане, за да се избегне надрязване в слоевете на кожата. Отляво надясно: държач за шайба, подложка за нарязване, режещо острие от въглеродна стомана и винтове. Нож за нарязване, поставен между държача на резени и подложката за нарязване, когато е сглобен. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

3. Събиране на pADSC от строма-съдовата фракция

  1. Прекарайте храносмилателната среда, съдържаща усвоената мастна тъкан, през един слой от шифон в чиста стерилизирана колба от 250 ml Erlenmeyer или 250 ml серологична колба. Използвайте клещи, за да притиснете центъра на шифона, за да направлявате и поддържате преминаването на дайджеста.
  2. Отцедете и завъртете шифона с клещи, за да завършите преминаването.
  3. Разпределете храносмилателната среда в четири 50 ml конични епруветки за центрофуга (

4. Идентифициране на маркери на повърхността на стволови клетки от pADSC чрез поточна цитометрия

5. Диференциация на pADSC в адипоцити, остеоцити и хондроцити

6. Оцветяване на диференцирани адипоцити, остеоцити и хондроцити

Представителни резултати

PADSC, получен от дорзална подкожна мастна тъкан на свине, се засява върху културалните плочи или съдове и се поставя в 2. Показано е, че морфологията на pADSC от съдовата фракция на стромата е подобна на ADSC от мишка или човек. Двадесет и четири часа след засяването, subconfluent pADSC се съобразява и има разширена подобна на фибробласти морфология (2А). PADSC ще се слее в рамките на 72 часа и е готов за адипоцити или друг мезенхимен тип диференциация (2 Б). pADSC показват силен адипогенен потенциал след химическа индукция и зрелите адипоцити могат да се различават след 9 дни с повече от 90% от pADSCs, показващи адипогенна диференциация (Фигура 2C) да се гледа.

За да се обърне внимание на свойствата на pADSC, разкрити в този протокол, повърхностните маркери на pADSC бяха оценени с помощта на анализ на поточната цитометрия. Както в 3 е показано е , Повърхностните маркери за мезенхимни стволови клетки, включително CD29, CD44, CD90 и MHC I (или HLA I), са силно изразени. Отрицателни повърхностни маркери като CD4a, CD31, CD45 и MHC II (или HLA II) трудно се откриват в pADSC, извлечен в протокола (Фигура 3). Тези резултати показват, че тези pADSC показват свойства на стволови клетки от мезенхимен тип без значително замърсяване с ендотелни или хематопоетични стволови клетки, включително миелоидни или лимфни предшественици.

За да се гарантира, че pADSC представлява мезенхимни стволови клетки, мултипотентността на pADSC е изследвана чрез диференциация в адипоцити, остеоцити и хондроцити. Тези адипоцити, остеоцити и хондроцити бяха оцветени съответно от специфични багрила, Oil Red O, Alizarin Red S и Toluidine Blue O, съответно. (Фигура 4). Тези данни показват, че този протокол произвежда pADSCs, които запазват му-типотентност с пълни свойства, подобни на предшествениците от мезенхимен тип.

мастна
Фигура 2. Морфология на pADSC от областта на свинското слабено. (А) Subconfluent pADSC се залепи и разпространи след 24-часово засяване върху 6-кладенчева културална плоча. (Б) След 72 h посяване, pADSC се слива върху 6-гнездна културна плака. (° С) Зрели адипоцити се наблюдават след 9 дни адипогенна диференциация чрез pADSC. Изображенията, направени при 100-кратно увеличение, са фазово-контрастна микроскопия. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

мастна
Фигура 3. Идентификация на стволови клеткиПовърхностни маркери за pADSC. 1 х 105 от pADSC бяха приложени със специфични антитела и анализирани за маркери на стволови клетки чрез поточен цитометричен анализ. Цифрите показват процента на оцветени клетки в популацията (червено) в сравнение с неоцветената контрола. Оста x представлява относителната интензивност на флуоресценцията. Оста Y представлява популацията от клетки. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

изолиране
Фигура 4. Диференциация на мултипотентни pADSC. Мултипотентността на pADSC се определя чрез диференциране на pADSC в (А) Определени адипоцити, (Б) Остеоцити (° С) Хондроцити и оцветени от представителни багрила, съответно Oil Red O, Alizarin Red S и Toluidine Blue O. Изображенията бяха в (А) взето 100 х (Б) 200 х и (° С) Увеличено 100X с помощта на фазова контрастна микроскопия. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

Дискусия

Тук представяме надеждна клетъчна система за изследване на развитието на мастна тъкан в първичната клетъчна култура на pADSC. В сравнение с други обезсмъртени клетъчни линии, този метод осигурява удобен начин за изолиране на големи количества висококачествени възрастни мезенхимни стволови клетки, които могат да се използват за изследване на процесите на диференциация на адипоцити или други мезенхимни линии, свързани с развитието на животните in vivo. Критичната стъпка в този модифициран протокол е, че можем да извлечем pADSC с 7- до 9-дневно прасенце, тъй като е лесно да се справя с малките прасенца в сравнение с по-възрастните прасета и подобни на други видове 19,20, които Добивът и мултипотентността pADSC намаляват, когато прасетата са на възраст 21 години.

Потенциалните източници на стволови клетки включват ембрионални стволови клетки (ESC), индуцирани плюрипотентни стволови клетки (iPS) и постнатални стволови клетки за възрастни. Ограничението на ADSC, класифицирано като възрастни мултипотентни стволови клетки, е, че мултипотентността на възрастните стволови клетки в дивергентни линии на диференциация е относително ограничена в сравнение с ESC или iPSC. Въпреки това етичните въпроси относно извличането на ESC и онкогенните свойства на iPS ограничават употребата на ESC и iPSC 22,23. Поради това многобройни изследователи са се фокусирали върху стволовите клетки на възрастни с усилия за подобряване на плюрипотентността. Най-честата причина за възрастни мезенхимни стволови клетки (MSC), която отдавна е изследвана, е мезенхималните стволови клетки, получени от костен мозък 24. Събирането на костен мозък обаче се счита за относително болезнена процедура. Друг проблем е, че добивът на стволови клетки от костния мозък е ограничен. Аспиратите на костен мозък са средно 6 × 10 6 ядрени клетки на ml, а MSC представляват само 0,001 до 0,01% от всички ядрени клетки. След като се разгледат тези недостатъци, ADSC се предлага като по-малко натрапчив източник за получаване на 25,26 мултипотентни стволови клетки.

Благодарности

Авторите благодарят на всички членове на лабораторията за подробното обсъждане и изразяват технологична подкрепа в този протокол. Изследванията, проведени в лабораторията, са подкрепени от безвъзмездни средства от Министерството на науката и технологиите (MOST 103-2314-B-002-126 и MOST 102-2313-B-002-026-MY3) и от безвъзмездни средства от Aim за най-добрия университет -Поддържан план (104R350144) Национален университет, Тайван.