Изолация на РНК - биология
Колко горещо е твърде горещо за живота дълбоко под дъното на океана?
Антибиотици от бактерии
Клетъчна миграция: новооткрита функция на известен протеин
Молекулярен компас за подравняване на клетките
Какво кара листата да стареят през есента
Демокрацията на лешоядите токачки
Околната среда на Ekembo: Хората също живееха в открити пейзажи
| Генетика | Земеделие, горско стопанство и животновъдство
Сортът пшеница е създаден чрез кръстосване на диви треви
Колко горещо е твърде горещо за живота дълбоко под дъното на океана?
Изолация на РНК
The Изолация на РНК от клетки дава възможност за анализ на текущата клетъчна активност в определен момент от времето, тъй като само гените, които в момента се транскрибират в клетката, са налични като РНК в момента на изолиране. По този начин изолирането на РНК е важна техника в молекулярната биология и изолираната РНК може да се използва в многобройни методи за анализ на генната експресия.
Специални функции при работа с РНК
RNases (ензими, които катализират разцепването на RNA на по-малки фрагменти) са изключително стабилни и все още могат да бъдат активни след автоклавиране. РНК е много податлива на деградация от RNases, чиято естествена задача е Mg 2+ -независимата хидролиза на фосфодиестерните връзки във фосфатния скелет на RNA. Следователно боравенето с РНК изисква повече грижи, отколкото работата с много по-стабилната ДНК. За да се избегне разграждането на РНК, РНК и РНКазите трябва да бъдат разделени една от друга на ранен етап и да се предотврати въвеждането на РНКази от околната среда в пробата. Следователно трябва да се носят ръкавици за еднократна употреба, тъй като RNases се произвеждат от всички организми и следователно присъстват и на повърхността на кожата в човешката пот. Освен това има смисъл да се използва определен набор от консумативи (пипети, кутии за пипети и др.) Само за експериментите с РНК. Освен това трябва да се използва специална вода без RNase.
Изолация на РНК
Както вече споменахме, при изолирането на РНК е много важно да се отделят РНКази от РНК възможно най-рано. Всички методи за изолиране на РНК се основават на лизирането на клетките в химическа среда, в която РНКазите бързо се денатурират. След това РНК се отделя от останалите клетъчни компоненти. По този начин се получава обща РНК. Тази обща РНК може да се използва директно за по-нататъшни експерименти (напр. Northern blot, обратна транскрипция в cDNA), или може да се използва като изходно вещество за изолиране на иРНК.
Метод на Хомчински и Саки
Този метод използва специален реагент (например TRIzol Reagent ® от Invitrogen или TriFast ™ от peqLab). Това прави възможно получаването на РНК от клетки или тъкан съгласно специфичен протокол. Тази процедура се основава на т.нар "Една стъпка" Метод по Хомчински и Саки. Trizol съдържа гуанидиниев тиоцианат, който лизира клетките и в същото време инактивира RNases и други ензими. Реактивът съдържа и фенол, в който се разтварят ДНК и протеини. Фазите се разделят чрез добавяне на хлороформ и след това центрофугиране. Тогава могат да бъдат разпознати три фази. Горната водна фаза съдържа РНК, интерфазната ДНК и долните протеини на хлороформната фаза. След това РНК във водната фаза се утаява с изопропанол или етанол. След две етапи на измиване РНК е в напр. Вода без RNase и е достъпна за допълнителни приложения.
Метод "Nonidet P-40"
Този метод не е подходящ за тъкан и се използва за получаване на иРНК от цитозола. Предимството на този метод е, че клетъчните ядра остават непокътнати и по този начин съществува възможност за изолиране на ДНК. Принципът се основава на нейонен детергент Nonidet P-40, който се добавя към клетките и ДНК (клетъчните ядра) се утаява като гранула след центрофугиране. РНК, протеини и клетъчни остатъци остават в разтвор. След това следва както при "Една стъпка" Изолиране на метод с фенол/хлороформ.
Комплектни системи
Като допълнителна опция за изолиране на РНК се предлагат много кит системи от различни компании и в множество дизайни (напр. RNeasy Mini Kit ® от Qiagen). Тези китови системи използват малки колони, които специфично свързват РНК.
Определяне на концентрацията чрез спектрофотометрия
Когато се определя концентрацията чрез спектрофотометрия, оптичната плътност се измерва при λ = 260 nm (OD260), максимумът на абсорбция на нуклеинови киселини (ДНК, РНК) и при λ = 280 nm (OD280), максимумът на абсорбция на протеините. Дали пробата е замърсена с геномна ДНК или протеини може да се определи от коефициента на OD260 и OD280. За чиста РНК съотношението трябва да бъде около 2,0. Ако стойността е под тази, пробата е замърсена с протеини, геномна ДНК и/или ароматни вещества. В този случай РНК трябва да се пречисти отново. Тъй като OD260 от 1 съответства на 40 µg/ml РНК, концентрацията на РНК може да се изчисли, като се използва следната формула:
Концентрация [µg/ml] = OD260 × 40 µg/ml × фактор на разреждане