Измерване на базална и форсколин-стимулирана липолиза в протока на ингвинални мастни мазнини

Обобщение

Този протокол описва метода за определяне на базална и форсколин-стимулирана липолиза в ингвиналните мастни буфери, получени от нормална диета (NCD) или диета с високо съдържание на мазнини (HFD), капсаицин, хранени с мишки от див тип. Като подсказка за липолиза, измерването на глицерол се измерва от ингвинални мастни подложки.

ингвинални

Резюме

Липолизата е процес, при който липидите, съхранявани като триглицериди в мастната тъкан, се хидролизират в глицерол и мастни киселини. Тази статия описва метода за измерване на основната липолиза и форсколин (FSK) в ингвиналните мастни буфери, изолирани от мишки от див тип, хранени с редовна диета (NCD), диета с високо съдържание на мазнини (HFD), или в диета с високо съдържание на мазнини, съдържаща 0,01% капсаицин (PAC: Ванилоид 1 (TRPV1) подсемеен агонист на преходния рецептор в продължение на 32 седмици. Методът, описан тук за извършване на ex vivo липолиза, е приет от Schweiger et al. 1 Представяме подробен протокол за измерване на нивата на глицерол чрез UV-видима спектрофотометрия (UV/VIS) .Методът, описан тук, може да се използва за успешно изолиране на мастни буфери ингвинална мазнина за измервания на липолиза, за да се получат последователни резултати Описаният протокол за ингвинални мастни буфери може лесно да бъде разширен за измерване на липолиза в други тъкани.

Въведение

Мастната тъкан съхранява енергията като мазнина 2, а за термогенезата 3, 4 е необходимо окисление на мастните киселини. Мастните киселини, погълнати от диети, са пълни с апопротеини в хиломикрони и доставени до различни тъкани в тялото чрез кръвообращението. Въпреки че повечето клетки в тялото съхраняват енергийни резерви, мастната тъкан съхранява излишната енергия като мазнини 5, 6. Липолизата в мастната тъкан се регулира от сложни процеси и молекулните детайли на липолизата остават неясни 7 .

Липолизата е процес, чрез който триглицеридите (TGL), съхранявани в мастната тъкан, се хидролизират, за да произведат глицерол и мастни киселини (FA) от ензима липозомна мастна липолиза (GLA) 8. Промените в базалната и стимулираната липолиза са отличителен белег на затлъстяването. BAsal липолизата се регулира чрез активиране на ATGL 9, което превръща TGL в диацилглицерол (DAG), който след това се хидролизира до моноацил глицерол (MAG). Активирането на хормоночувствителна липаза (HSL) от аденилил циклаза активира стимулиране на аденозин и цикличен монофосфат (cAMP) зависима протеин киназа А (PKA) и индуцира липолиза. Следователно измерването на липолиза, основна и стимулирана, е важно за анализиране на активността на протеините, участващи в този процес. В допълнение, развитието на молекулярната регулация на липолизата може да бъде от полза при разработването на нови терапевтични стратегии срещу затлъстяването 10. Тъй като молекулите, които стимулират липолизата и окисляването на мастните киселини, са потенциални кандидати за намаляване на мазнините, съхранявани в депата, важно е да се използва надежден тест за възпроизводимост.

По-рано публикувани данни предполагат, че активирането на протеина TRPV1, експресиран в бяла мастна тъкан от CAP усилен базален и FSK (аденилил циклаза) стимулира липолиза в ингвиналната мастна тъкан 11. Предишни изследвания също предполагат, че дългосрочното активиране на TRPV1 от CAP активира PKA 12. Тъй като активирането на PKA стимулира липолиза 13, 14, измерва както базално стимулираната липолиза, така и стимулираната PKA в ингвиналната мастна тъкан, изолирана от NCD или HFD (± CAP) мишки след 32 седмици хранене, съответните режими ще потвърдят ролята на TRPV1 активирането при липолизата.

Тази статия описва ефективен метод за определяне на базална и стимулирана липолиза. Въпреки че са налични други методи, които използват радиоактивни изотопи на глицерол и обилна високоефективна течна хроматография или газова хроматография/масспектрометрия за измервания 15, 16, този метод предлага по-директна, ясна и рентабилна техника за определяне на липолиза в мастната тъкан.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Всички протоколи следват указанията на Университета на Уайоминг за грижа за животните.

1. Жилища и фуражи за животни

ЗАБЕЛЕЖКА: Възрастни мишки от див тип (C57BL/6) (12 до 24 седмици) се отглеждат в изследователското съоръжение за развъждане съгласно протоколи, одобрени от Институционалния комитет за грижа и използване на животните (IACUC).