Индукция на ускорена атеросклероза при мишки Протоколът за модел на телесно нараняване (преведено на
Обобщение
Това проучване описва инвазивен метод за предизвикване на ускорена атеросклероза при мишки. В сравнение с други методи, които използват електрически или крио-индуцирани наранявания, механично причиненото нараняване имитира човешкото състояние на рестеноза след реваскуларизационни терапии и е идеално за изследване на участващите молекулярни механизми.
Резюме
Атеросклерозата е пролиферативно фибро-възпалително заболяване, което се развива в артериалната стена и предизвиква недостатъчен кръвен поток или дефицит на кръвен поток. В допълнение, артериосклерозата предизвиква образуване на оклузивен тромб чрез разкъсване на дефектната съдова стена, което е основната причина за миокарден инфаркт или инсулт и най-честата причина за смърт. Въпреки напредъка в сърдечно-съдовата област, много въпроси остават без отговор и допълнителни основни изследвания са от съществено значение за подобряване на нашето разбиране за молекулните механизми, участващи в атеросклерозата и нейните последици. Поради ограничени клинични проучвания се изискват представителни животински модели, които симулират атеросклеротични заболявания като неоинтимална формация след имплантиране на стент, балонна ангиопластика или ендартеректомия. Тъй като мишката предлага много предимства и е най-широко използваният модел за изследване на молекулярни процеси, настоящото изследване предлага инвазивен метод на ендотелна денудация, известен също като модел на нараняване на тел, който е представител на човешкото състояние на образуването на неоинтима в артериите след реваскуларизационни процедури е.
Въведение
Основният недостатък на модела на мишката е малкият размер на основните артерии, изложени на атеросклеротично заболяване (каротидната артерия, аортата и бедрената артерия), които изискват квалифицирани хирургически знания и умения за манипулиране на съдовете и инвазивна индукция на атеросклеротична плака. Следователно, моделът на ускорено образуване на неоинтима, предложен в тази статия в контекста на рестеноза след ендартеректомия или поставяне на стент, е представен с поетапни насоки и предложения за улесняване на въвеждането на заинтересования персонал. Друг недостатък е, че денудацията се появява на нормалната артериална стена и следователно образуването на нео-интима ще бъде умерено в сравнение с клиничната ситуация. Високите нива на плазмен холестерол, постигнати при аполипопротеин Е нокаут (Apoe -/-) мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, създават подходяща противовъзпалителна среда, необходима за образуването на нео-интима.
Операцията се извършва под стерео микроскоп. Каротидната артерия е изложена през медианния разрез в предната цервикална област. Анатомичните структури на и около каротидната артерия са минимално манипулирани, за да се намали следоперативното възпаление. Прекъсва се раздвоението на каротидната артерия. За да се ускори образуването на неоинтима, вътрешните и външните каротидни артерии са подготвени за прихващане на потока и последващ чест отказ на каротидна артерия. В обобщение, методът може да се научи от персонал с минимален опит в хирургията на животни.
Протокол
Експериментите, представени в тази статия, се извършват в съответствие с германското законодателство и европейските насоки за грижа за животните. Животните се държат в съоръжението за животни на Института за лабораторни животински науки, Университетска болница Аахен, под ръководството на проф. Д-р. Р. Толба и д-р. А. Теубнер (служител за хуманно отношение към животните).
- Дръжте мишките в специализирано приемно звено, за да осигурите адекватен достъп до храна и специализиран ветеринарен контрол и лечение. Ако животните се преместват или купуват от трета страна, моля, осигурете едноседмичен период на настаняване, преди да преминете през процедурата.
- 6 - 8 седмична възраст, фураж 18 - 20 g, женски (по избор) ApoE -/- мишки с атерогенна диета (21% мазнини, 0,15% холестерол, 19,5% казеин, Wt/Wt) една седмица преди операция и продължете с диета, докато се направи анализ на атеросклеротична плака.
3. Хирургическа подготовка
- Отстранете прибиращите устройства и върнете мускулния слой и две мазнини във физиологичното положение.
- Затворете кожата с три отделни 0/6 конца, ако са необходими ехокардиографски измервания. Ако не се изисква изображение, използвайте метални щипки, за да затворите кожата.
- Поставете мишката под инфрачервената светлина от лявата страна, докато се събуди. Не оставяйте животно без надзор или с други животни, докато то бъде напълно възстановено.
- Маркирайте мишката за бъдеща идентификация с локалната система. Попитайте служителя за хуманно отношение към животните в местното съоръжение.
6. Анализ на атеросклеротична плака
Представителни резултати
Процедурата за индуциране на атеросклеротична плака отнема 15-20 минути и показва минимална смъртност, главно поради кървенето, което се случва по време на процедурата. След операцията мишките се възстановяват от упойка в рамките на 20-25 минути. След операцията не са наблюдавани физически увреждания като парализа или нарушения на храненето.
Нараняването на проводника индуцира деендотелизация, която имитира съдови лезии след балонна удация или имплантиране на стент. Веднага след нараняването, оголената съдова стена ще бъде покрита със слой тромбоцити, който посредничи и благоприятства адхезията на моноцитите 12. Активираните гладки мускулни клетки от медиите се размножават и мигрират в интимните пространства, които образуват неоинтима. Други предшественици на гладкомускулни клетки мигрират от кръвта (около 40%) и допринасят за неоинтималния растеж. Образуването на плака завършва след пълна ре-ендотелизация, обикновено 4 седмици след нараняване на жицата.
Образуването на неоинтима може да се оцени с оцветяване на Movat. Размерът на плаката се изчислява за всеки слайд с помощта на софтуер, както в Фигура 2Бпоказани. Общият размер на плаката (лява каротидна артерия) може да варира между 70 000 и 100 000 m2, докато размерът на контролния съд (дясна каротидна артерия) може да варира между 7 000 и 8 000 m2. Тези стойности до голяма степен зависят от хирурга. Ето защо силно препоръчваме да се използва един и същ хирург за едно и също изследване по време на експериментите.
Разработената плака наподобява рестеноза на стента, която се състои предимно от реплицирани и мигрирали гладкомускулни клетки от средата. в стент Клетъчният състав, определен чрез имунологично оцветяване, показва, че съдържанието на гладкомускулни клетки е около 30-40%, докато макрофагите се намират в 15-25% от неоинтимите на увредения съд. Реендотелизацията може да бъде измерена след оцветяване на ендотелен маркер и изчислена като процент от обиколката, която е оцветена по цялата обиколка на лумена. По правило ре-ендотелизацията достига 80 - 90% след 3 седмици и трябва да бъде почти завършена след 4 седмици (Фигура 2С). За да се проследи нарастването на плаката, докато се развива, същият анализ може да се повтори за всеки момент от времето след нараняване на проводника, в зависимост от интереса и изследваната тема (вж. маса 1).
Дискусия
В този пост ние предлагаме полезни съвети за извършване на процедурата за нараняване на жици дори от служители с минимален опит в хирургията на животни. Има две критични стъпки при извършването на тази процедура: разрязване на външната сънна артерия и поставяне на жицата. Разрезът на външната каротидна артерия трябва да се направи възможно най-далеч от бифуркацията, за да се осигури достатъчно остатъчен материал (Фигура 1С). Разрезът не трябва да е твърде голям, тъй като съществува риск от изрязване на целия съд. Втората критична стъпка е високият риск от кървене по време на артериотомията и поставянето на водещия проводник, ако кръвният поток не се контролира ефективно. Освен това, ако водещата жица не е правилно поставена в луменния съд, не може да възникне дендулация на ендотел или артериално разкъсване. За да се избегне това, повърхността на водещия проводник трябва да бъде внимателно полирана преди работа.
За да оптимизира протокола, позицията на операционната маса с главата на мишката по посока на хирурга осигурява по-добра видимост, достъпност и контрол за правилната манипулация на водещия проводник. Освен това, за да увеличите възпроизводимостта, използвайте един и същ проводник във всички изследвания. Тъй като размерът на проводника не се променя, важно е да се отчетат и премахнат всички възможни разлики между мишките, като се използва един и същи пол, възраст и тегло за всички мишки, включени в проучване. След това оцветяването на Evans-Blue ще помогне на хирурга да определи ефективността на денудацията. Наличието на подходящо оборудване е предпоставка за успеха на процедурата. 10x стерео микроскоп е от съществено значение за извършване на тази процедура. Правилната подготовка на водещия проводник (напр. Полиране) е от решаващо значение. Ето защо горещо препоръчваме подготовката на проводниците да се извършва от специализиран технически персонал, ако има такъв.
Този дневник има много стъпки за отстраняване на неизправности. Ако разрежете външната сънна артерия близо до бифуркацията, внимателно завържете външните части близо до бифуркацията, за да не се получи кървене. Външната каротидна артерия не може да се види при рязане. Ето защо, помислете за раздвоението на нивото на копринения шев. Съберете секции, когато коприненият шев изчезне. Ако разрезът на външната каротидна артерия е твърде голям и съдът е счупен, уверете се, че притокът на кръв към каротидната комуна и вътрешната каротидна артерия е ефективно прекъснат и се опитайте да намерите отвора на съда с форцепс. След вкарване на проводника и оголване, завържете съда близо до раздвоението. Докато режете, започнете да събирате, когато коприната започне да изчезва от шева. Ако по време на денудация с направляващата жица настъпи разкъсване на артерията, проверете под микроскоп дали направляващата жица е правилно полирана.
Въпреки сходството на модела на телесно нараняване с клинични ситуации, много групи се фокусират върху местната атеросклероза при мишки или избират инвазивни индукции на атеросклероза, като балонна ангиопластика при плъхове или зайци, поради липсата на обучен персонал, способен да извършва дребномащабни операции върху животни. Въпреки предимствата на използването на зайци/плъхове, напр. Например, без миниатюризирано оборудване, нито модели на плъхове, нито заеци предлагат голямо разнообразие от различни нокаутиращи щамове за изследване на молекулярните механизми, участващи в неоинтималния растеж и тромбозата в стента.
Денудацията се извършва на нормалната артериална стена, макар и с атеросклеротичен фон. Следователно образуването на неоинтима ще бъде умерено в сравнение с клиничната ситуация. Големият брой предклинични модели показва, че нито един от моделите не отговаря на всички критерии, необходими за разкриване на съвкупността от клетъчни и молекулярни механизми, които водят до патофизиология при хората (вж. Таблица 2).
След приключване на процедурата за нараняване на тел, могат да се извършват други биологични и молекулярни анализи за идентифициране на клетки, протеини, иРНК, микроРНК, гени или други биомаркери, които могат да се използват като терапевтични цели за разработване на нови стратегии за лечение на атеросклероза, и по-специално за образуване на неоинтима след съдово увреждане . Ако е възможно, растежът на плаката може да се наблюдава с високочестотен ултразвук или други техники за образна диагностика с висока резолюция. В допълнение, овладяването на тази техника би позволило на оператора да адаптира протокола към други инвазивни модели на индукция на атеросклероза, като: Б. Поставяне на яка, частично лигиране или дори имплантиране на стент.