Индукция на исхемичен инсулт и исхемия-реперфузия при мишки, използващи оклузия на средната артерия

Въведение

Изследването на сърдечно-съдови заболявания като инсулт се основава на използването на in vivo модели. За да се разберат възможните ефекти от исхемия, лекарствена токсичност и/или лечение, е необходимо да се използва подходящ, стандартизиран, надежден и възпроизводим модел на заболяването, който позволява сравнителни изследвания между лечебните групи. В този ръкопис използваме мишки поради наличието на голям брой трансгенни мишки и стандартизирани модели за оценка. Резултати от оценката за оценка на двигателни и поведенчески дефицити след експериментален исхемичен инсулт и след възстановяване бяха разработени 1, 2.

Предлагат се няколко модела на исхемичен инсулт, като пълна глобална церебрална исхемия, непълна глобална исхемия, мултифокална церебрална исхемия и фокална церебрална исхемия. Последната група е и категорията на инсултите, най-често срещана при пациенти. По-голямата част от навечерието се инициира от образуването на емболична или тромботична оклузия върху или близо до средната церебрална артерия (MCA). На фона на тези параметри моделът имитира болестната етиология на човешкия инсулт и прави получените резултати изключително релевантни 3. Независимо от това преводът на открития от животински модели към лечението на заболявания при хора се оказа труден. Досега за лечение на остър исхемичен инсулт е одобрено само използването на тромболитичен тъканен плазминогенен активатор 4.

Сред моделите на фокална церебрална исхемия при мишка, моделът на мозъчния инсулт на задната циркулация и моделът на тромбоза на мозъчните вени са много инвазивни, намалявайки тяхната приложимост и ограничавайки обхвата на анализите, които могат да бъдат извършени. Въпреки това, други техники, като емболичен модел, модел на фототромбоза, модел на инсулт, предизвикан от ендотелин-1, и модел на интралуминален шев на мозъчна артериална оклузия (MCAO) са на разположение за използване без такива ограничения. Моделът MCAO е техника, описана в този протокол. Той осигурява надежден метод за предизвикване на фокална церебрална исхемия, който лесно може да бъде възстановен и извършен по начин с висока производителност. Има два подхода към този модел, а именно методите Zea-Longa и Koizumi. Те се различават донякъде по начина, по който оклузионният шев се въвежда във васкулатурата. При техниката Zea Longa конецът се вкарва през външната каротидна артерия 5. Представената тук техника е модифицирана от процедурата на Коидзуми, при която запушващият шев се поставя върху общата каротидна артерия 6.

Моделът MCAO е успешно приложен за оценка на различни събития по време на исхемичен инсулт. След реперфузия може да се наблюдава мозъчен оток заедно с разрушаването на кръвно-мозъчната бариера. Пиковата нервна смърт обикновено се наблюдава на 24 часа; Въпреки това, той може да се върне към първоначалното ниво след 7 дни 7. При хората полът и възрастта са важни променливи при определяне на резултатите от инсулт; това се наблюдава и при мишки и плъхове 8, 9, 10. Няколко публикации показват модела MCAO които са използвали ефективност на лечение 11, 12, 13, 14.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Всички процедури бяха одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните в Университета в Маями (IACUC) в съответствие с насоките на Националните здравни институти (NIH). Необходима е употреба в стерилно оборудване и асептични техники.

1. Подгответе оклузионния шев

  1. Използвайте шев с диаметър 0,21 mm за мишки между 20-25 g и 0,23 mm за мишки между 25-35 g телесно тегло. Изборът на вида на конците за процедурата MCAO се основава на теглото на животните.
  2. Със сребърна писалка маркирайте шева, започвайки на 9 мм от върха със силиконово покритие. Това ще служи като ориентир за дължината на инсталацията.

2. Подготовка за операция

3. Дисекция на общата каротидна артерия и вътрешно/външно разклоняване

4. Подготовка на CCA за поставяне на конци MCAO

  1. Поставете три сегмента от найлонова нишка с дължина около 4 инча под CCA. Уверете се, че CCA не е усукан, тъй като това драстично би затруднило поставянето на шева.
  2. Във възможно най-ниската точка завържете долния шев в постоянен възел.
  3. Завържете горния шев точно под кръстовището ICA/ECA с помощта на подвижен плъзгащ се възел.
  4. Завържете средния шев с помощта на подвижен работещ възел, но го дръжте широко отворен. Важно е да оставите много място, тъй като това няма да попречи на вмъкването на шева.
  5. С микродисекционна пружинна ножица направете разрез в CCA между долния и средния конци. Направете разрез от 0,2 мм близо до долния шев.

5. Запушване на средната церебрална артерия

6. Затваряне на разрез и следоперативни грижи

  1. Анестезирайте животното отново (следвайте указанията в 2.1) и премахнете конците за затваряне на рани.
  2. Използвайки форцепс и тъканни сепаратори, отворете отново разреза и изложете CCA.
  3. Внимателно отстранявате горния шев и внимателно издърпвате MCAO шева, докато покритата със силикон част е в средата на възела.
  4. Повторете горния възел върху шева, за да предотвратите изтичането на кръв през шева (не е задължително да е плъзгащ възел).
  5. Разхлабете внимателно средния възел и издърпайте шева покрай горния възел, но го задръжте в рамките на CCA.
  6. Затворете плътно артерията на горния възел, за да блокирате притока на кръв.
  7. Издърпайте напълно шева MCAO и плътно затворете средния възел.
  8. Шевът MCAO може да се използва повторно няколко пъти. След всяка употреба внимателно почиствайте конците в 70% етанол, за да отстраните замърсителите (например кръв или тъкан) със стерилна марля. След това поставете шева в торба за стерилизатор и го стерилизирайте.
  9. Повторете стъпки 6.1-6.4 и наблюдавайте възстановяването на животните.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

В допълнение към изучаването на ударния обем, имунофлуоресценцията може да се извърши за различни цели, като свързан с микротубули протеин-2 (MAP2) за увреждане на невроните (3A) или глиален фибриларен киселинен протеин (GFAP) за астроглиоза (3B). Такива анализи допълнително дават възможност за анализ на прогресията и възстановяването на инсулт, както и на други процеси, свързани с увреждане и възстановяване на инсулт.

исхемия-реперфузия
Илюстрация 1: rong> Схематично представяне на мозъчната артериална физиология. Направете MCAO вмъкването продължава от общата каротидна артерия (CCA) до зоната на оклузия, посочена в синьо. (:;: Среден шев; BS: долен шев MS горен шев TS) Хирургичната зона е в долния край на фигурата (овална форма) и разположението на шева е обозначено с черни линии. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

индукция
Фигура 2: TTC - Оцветяване на участъци от мозъка. Горният панел представлява типично оцветяване след фалшиво вмъкване. Получават се 90 минути или 24 часа реперфузия на средните и долните плаки след 60-минутно MCAO. Мащабната лента е 1 мм.

3 "src ="/files/ftp_upload/54805/54805fig3.jpg "/>Фигура 3: След инсулт имунофлуоресцентно оцветяване на мозъка на мишка. След 60-минутна оклузия мозъците се събират в продължение на 23 часа и се обработват за реперфузионно крио-рязане. С антитела срещу MAP2 (отгоре) и GFAP (отдолу) тъканта се анализира за невронални наранявания и астроглиоза или фиктивни (леви полета), или 90 минути мозък на исхемия-реперфузия (десни полета). Представените изображения са взети от множество изображения, комбинирани чрез конфокална микроскопия, използвайки 10X обектив. Мащабната лента е 1 мм. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

маса 1. Измерител за преценка на мишката - Състояние и невродефицит след инсулт на исхемия. Коригирано от 1, 2.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

В зависимост от опита на потребителя, този метод може да се използва с висока производителност за изследване на голяма група животни. Статистическата значимост на проучванията върху животни зависи от използването на достатъчен брой субекти между лекуваните групи, въпреки признаването на присъщи разлики между тестваните животни. Представеният протокол дава възможност за такива проучвания, като същевременно пресъздава отблизо части от болестния процес.

Предимството на техниката MCAO е, че въпреки че включва някои хирургични процедури, тя не изисква много инвазивни процедури, както в модела на краниотомия. В допълнение, той е силно възпроизводим и реперфузията е силно контролируема, което не е възможно при моделите с ендотел-1 или емболичния инсулт. Техниката имитира процеса на човешки исхемичен инсулт и произвежда наранявания, характерни за тъканите, наблюдавани при хора, което не е случаят с модела за фототромбоза. В сравнение с други публикувани техники, процедурата MCAO няма да изисква каутеризиране на ECA. Това е предимство, тъй като може да се комбинира с нашия ICA инфузионен модел за доставяне на терапевтични агенти до засегнатото полукълбо след индукция на инсулт 23, 24, 25.

В допълнение към тъканния анализ, поведението на животните може да се наблюдава надлъжно, за да се оцени тежестта на инсулта и възстановяването. Това може да помогне за сравняване на възстановяването между различните групи на лечение. Разработени са няколко подхода за оценка на поведението. Проста скала от 5 точки може да се използва за оценка на неврологичния дефицит след инсулт (0: липса на дефицит на поведение; 1: липса на контралатерално уголемяване на предната лапа; 2: кръгове от противоположната страна на инфаркта; 3: капани от противоположната страна на инфаркта; 4: Ниско ниво на съзнание и спонтанно движение) 5. Освен това може да се извърши задълбочен анализ на състоянието и поведението на животното, за да се оцени възстановяването като 2 в маса 1 1 описано.

Представената хирургична процедура използва механична процедура за предизвикване на инсулт, която при проучвания за чувствителност към инсулт ограничава използването на тази техника и/или патогени. Този протокол обаче може да бъде изключително полезен при анализ на тежестта на инсулта, неговите стратегии за избягване или ограничаване, утежняващи фактори и възможни терапевтични подходи след инсулт. Сравнението между лечебните групи може да помогне да се идентифицират потенциалните лечения, които могат да сведат до минимум увреждането от инсулт или бързото възстановяване. Всъщност подпомагането на пациентите с инсулт да подобрят възстановяването би било от голямо значение.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.