Имунохистохимичен и клетъчен биологичен анализ на човешки моноклонални антитела срещу колоректална

От Патологичния институт на Изпълнителния съвет на университета във Вюрцбург: професор д-р. мед. H.K. Müller-Hermelink Имунохистохимичен и клетъчен биологичен анализ на човешки моноклонални антитела срещу колоректален карцином Инаугурационна дисертация за получаване на докторска степен от Медицинския факултет на Баварския университет на Юлий Максимилианс във Вюрцбург, представена от Джудит Лоренц от Фулда Вюрцбург, юни 2004 г.

Лектор: професор д-р обратно нат. Д-р мед. H.P. Сърефер на Волмер: професор д-р. мед. H.K. Мюлер-Хермелинк Декан: професор д-р мед. S. Silbernagl Ден на устния изпит: 21 януари 2005 г. Докторантът е лекар

моите родители, Улрих и Кристиан

Съдържание 1 Въведение 1 1.1 Колоректален карцином 1 1.2 Моноклонални антитела 6 1.3 Цел на работата 11 2 Материали и методи 12 2.1 Материал 12 2.1.1 Буфери, разтвори и среди 12 2.1.2 Химикали и антитела 13 2.1.3 Човешки моноклонални антитела 14 2.1 .4 Клетъчни линии 15 2.1.5 Консумативи и лабораторно оборудване 15 2.1.6 Софтуер и хардуер 16 2.2 Методи за имунохистохимия 17 2.2.1 Приготвяне на замразени секции 17 2.2.2 Фиклолов градиент и подготовка на цитоспини 17 2.2.3 Имунопероксидазно оцветяване на криосекции и цитоспини 18 2.3 Методи за клетъчна биология 20 2.3.1 Клетъчна култура 20 2.3.2 Тест за разпространение (MTT анализ) 20 2.3.3 Откриване на клетъчна смърт ELISA PLUS (Roche, Mannheim) 21

3 Резултати 23 3.1 Оцветяване с имунопероксидаза 23 3.1.1 Колоректални карциноми 24 3.1.2 Нормална тъкан 28 3.1.3 Фетална тъкан 34 3.1.4 Туморна тъкан 35 3.2 Тест за пролиферация (MTT анализ) 39 3.3 Откриване на клетъчна смърт ELISA PLUS (Roche, Mannheim) 42 4 Дискусия 45 5 Резюме 58 6 Библиография 59 7 Списък на съкращенията 75 Благодарности CV

Въведение 11 1.3 Цел на дипломната работа В тази дипломна работа, три човешки моноклонални антитела, които са разработени в работната група на проф. Д-р. H.P. Vollmers в Патологичния институт на университета във Вюрцбург с помощта на хибридомна технология (описана в: Vollmers et al., 1989) са изолирани от пациент с рак на ректума, изследван по отношение на кръстосаната реактивност със здрава и злокачествена дегенеративна тъкан. За тази цел бяха проведени имунопероксидазни петна върху замразени участъци от различни нормални и фетални тъкани и върху множество видове тумори. Освен това, влиянието на антителата върху поведението на растеж на различни клетъчни линии на карцином на дебелото черво се характеризира in vitro с помощта на два функционални клетъчни биологични теста (MTT анализ, Cell Death ELISA PLUS). Данните, получени чрез настоящата работа, трябва да предоставят първоначална информация за пригодността на антителата като терапевтични средства за злокачествени тумори на дебелото черво и по този начин евентуално да формират основата за по-нататъшни изследователски подходи.

Материал и методи 12 2 Материал и методи 2.1 Материал 2.1.1 Буфери, разтвори и среди PBS: 8 g NaCl 0,2 g KCl 1,15 g Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O 0,2 g KH 2 PO 4 1 l А. бидист. Tris/NaCl: Разтвор 1: 4,5 л А. редист. 40,5 g разтвор на NaCl 2: 1 l А. редист. Нагласете 6 g трис (хидроксиметил) аминометан до рН 7.6 с димяща HCl, регулирайте разтвор 1 и 500 ml разтвор 2 до рН 7.4 BSA/PBS: 5 mg BSA (албумин говежди, фракция V; Roth, Karlsruhe)/ml PBS DAB реагент: 5 ml чешмяна вода 1 DAB таблетка, 1 таблетка водороден пероксид (5 ml Sigma Fast 3,3'-Diaminobenzidine Tablet; Sigma, Steinheim) MTT реагент: 3- (4,5-диметилтиазол-2- ил) -2,5-дифенилтетразолиев бромид (Sigma, Steinheim) 5 mg/ml PBS Обезмаслено мляко на прах: от магазина за здравословни храни, 3 или 5% в PBS

Материал и методи 13 Трипаново синьо: 0,5% трипаново синьо (Sigma, Steinheim) 0,9% NaCl Заешки серум: Linaris, Wertheim-Bettingen Човешки серум: от Катедрата по трансфузионна медицина към Университета във Вюрцбург RPMI 1640: базова среда (500 ml) (PAA Laboratories, Линц/Австрия) 1% глутамин (5 ml) 1% пеницилин/стрептомицин (5 ml) 10% FCS (фетален телешки серум) (50 ml) загрейте до 37 C преди употреба Трипсин/EDTA: PAA Laboratories, Линц/Австрия 2.1. 2 Химикали и антитела Химикалите и антителата са получени от следните компании: Ацетонова клетка за откриване на смърт ELISA PLUS DMSO (диметилсулфоксид) Fico Lite H Разделителна среда Глицерин желатин Hemalaun Tissue-Tek Mallinckrodt Baker, Девентер/Холандия Roche, Mannheim Merck, Дармщадте Linaris Merck, Darmstadt Merck, Мюнхен Sakura Finetek, Zoeterwoude/Холандия Анти-цитокератин (CAM 5.2) Реагент Becton Dickinson, Белгия

Материал и методи 15 2.1.4 Клетъчни линии Експериментите са проведени върху установените линии HT-29, CACO-2, COLO 206F и COLO 320. С изключение на COLO 320, всички показват прилепнал растеж в бутилката за култивиране. Култивирането се извършва в RPMI 1640 среда/1% глутамин/1% пеницилин/стрептомицин/10% FCS при 37 C и 7% CO 2. 2.1.5 Консумативи и лабораторно оборудване Консумативите са доставени от следните компании: Combitips пипети Покривни стъкла Камера за преброяване Neubauer Слайдове, накрайници за пипети, съдове за реакция и пластмасови контейнери, S-моновети и канюли, плочи и бутилки за клетъчни култури, карти за цитофилтър, Eppendorf, Хамбург, Асоциация на лабораторните специалисти Hartenstein, Würzburg Menzel; Langenbrinck, Emmendingen Greiner, Frickenhausen; Хартенщайн, Вюрцбург Грейнер, Фрикенхаузен; Hartenstein, Würzburg Sarstedt, Nümbrecht Greiner, Frickenhausen Hartenstein, Würzburg Устройствата, използвани за работата, идват от следните компании: Aquabidest system Milli-Q Plus PF инкубатори ELISA читатели Millipore, Molsheim Heraeus, Hanau Bio-Rad, Мюнхен

Материал и методи 16 Фризер (-70 C) Cryostat 2800 Frigocut N Хладилник и фризер Магнитна бъркалка IKAMAG RTC микроскоп DMLB фазов контрастен микроскоп DMIL ph-метър ph 525 пипети помощ за пипетиране акумулаторна стерилна пейка Lamin Air Vortex-Genie баланс водна баня Minitherm 2 центрофуга Минифуга T цитоспин центрофуга 2 Heraeus, Hanau Reichert-Jung, Nussloch Quelle, Fürth Janke & Kunkel, Staufen Leica, Wetzlar Leica, Wetzlar WTW, Weilheim i. Кмет Eppendorf, Хамбургска марка, Wertheim/Main Heraeus, Hanau Bender & Hobein, Цюрих/Швейцария Sartorius, Göttingen Dinkelberg-Labortechnik, Neu-Ulm Heraeus, Hanau Shandon, Великобритания 2.1.6 Софтуер и хардуер За графичното представяне на резултатите Използвани програми EXCEL и POWERPOINT (Microsoft, САЩ). Фотографските записи на тъканните секции са направени с помощта на цифровия фотоапарат Nikon Coolpix 990 (Nikon, Япония) и микроскопа DMLB (Leica, Wetzlar) в увеличение 100, 200 и 400 пъти, а разпечатката е направена на фотохартия (Hewlett Packard, САЩ) от цветен принтер от същата марка.

Резултати 25 Резултатите от оцветяването с HH 98/81-33-154 и HH 99/71-81-149 бяха и двете идентични и ако тези две антитела реагираха положително, оцветяването с HH 101/99-14 също беше положително . Такъв беше случаят с общо 7 карцинома. Фигури от 1 до 4 показват пример за положително оцветяване с HH 98/81-33-154 и HH 99/71-81-149, както и по-слаба и силна реакция на HH 101/99-14 към колоректална туморна тъкан. За сравнение, отрицателните реакции на трите антитела с не-неопластична тъкан на дебелото черво са показани на фигура 5. a b c Фиг. 1: Увеличаване на аденокарцинома на дебелото черво: 100 пъти a: положителна контрола (CAM 5.2) b: отрицателна контрола (L11/64-28) c: положителна реакция с антитялото HH 98/81-33-154

Резултати 26 abc Фиг. 2: Увеличаване на дебелото черво на аденокарцинома: 10x a: Положителна контрола (CAM 5.2) b: Отрицателна контрола (RPMI 1640) c: положителна реакция с антитялото HH 99/71-81-149 abc Фиг. 3: Увеличаване на дебелото черво на аденокарцинома: 10 пъти a: положителна контрола (CAM 5.2) b: отрицателна контрола (L11/64-28)) c: слабо положителна реакция с антитялото HH 101/99-14

Резултати 27 a b c d Фиг. 4: Аденокарцином на цекума, съдържащ пръстеновидни клетки с печат Увеличаване: 200 пъти a: HE оцветяване b: положителен контрол (CAM 5.2) c: отрицателен контрол (RPMI 1640) d: силно положителна реакция с антитялото HH 101/99-14

Резултати 28 abcd Фиг. 5: Увеличаване на дебелото черво в нормална тъкан: 200 пъти a: отрицателен контрол (L11/64-28) b, c, d: отрицателни реакции на антителата HH 98/81-33-154, HH 99/71-81-149 и HH 101/99-14 с не-неопластични жлези на дебелото черво 3.1.2 Нормална тъкан Тъй като свързаните с тумора антигени, разпознати от антителата, могат да бъдат молекули, които също се експресират от здрави клетки, е необходимо да се идентифицират възможни кръстосани реакции на Да разкрие антитела с важни органи, за да може да се направят първоначални заключения относно съвместимостта на антителата при по-късна терапевтична употреба.

Резултати 30 Орган No. HH 98/81-33-154 HH 99/71-81-149 HH 101/99-14 намерен. + + + Дебело черво 3 0 3 0 3 0 3 Ректум 3 0 3 0 3 0 3 Панкреас 2 0 2 0 2 0 2 Черният дроб 3 не може да бъде оценен Далак 3 не може да бъде оценен Тимус 3 0 3 0 3 0 3 Тонзила 3 0 3 0 3 0 3 лимфни възли 3 0 3 0 3 0 3 надбъбречна жлеза 3 0 3 0 3 0 3 бъбрек 3 0 3 0 3 0 3 пикочен мехур 3 0 3 0 3 0 3 ductus deferens 3 0 3 0 3 0 3 простата 3 0 3 0 3 0 3 тестиса 3 0 3 0 3 0 3 гърда 3 0 3 0 3 0 3 яйчник 3 0 3 0 3 0 3 туба матка 3 0 3 0 3 0 3 корпус матка 2 0 2 0 2 0 2 шийка матка, порция ваг. 2 0 2 0 2 0 2 кожа 3 0 3 0 3 0 3 скелетна мускулатура 3 0 3 0 3 0 3 плацента 1 0 1 0 1 0 1 гръбначен мозък 3 0 3 0 3 3 0 мозъчна кора 3 0 3 0 3 1 2 малкия мозък 3 0 3 0 3 3 0 Corpus pineale 2 0 2 0 2 2 0 Хипофизна жлеза 3 0 3 0 3 3 0 Костен мозък 2 0 2 0 2 0 2 Кръв 2 0 2 0 2 0 2