Идентифициране на сайтове за геномно свързване на фактор на транскрипция в остро пречистен PDGFR; Клетки от
Обобщение
Тук представяме протокол, предназначен да анализира обширно геномно свързване на транскрипционния фактор олигодендроцит 2 (Olig2) в остро пречистени мозъчни олигодендроцитни родословни клетки (OPC) чрез извършване на нискоклетъчно хроматиново имунопреципитация (ChIP), подготовка на библиотека, последователност с висока производителност и биоинформатичен анализ на данните.
Резюме
Въведение
Важно е да се изследва свързването на протеина (или протеиновия комплекс) с ДНК и епигенетичните маркери за изграждане на транскрипционни регулаторни мрежи в различни биологични процеси. По-специално, връзките между транскрипционните фактори и геномната ДНК могат да играят важна роля в генната регулация, клетъчната диференциация и развитието на тъканите. Това е мощен инструмент за изследване на транскрипционната регулация и епигенетичните механизми на хроматиновото имунопреципитация (ChIP). Поради бързия напредък в технологията за секвениране от следващо поколение, анализът на свързването на протеин-ДНК и епигенетичните маркировки се използва в 1 ChIP, съчетан с високопроизводително ДНК секвениране (ChIP-Seq). Стандартният протокол ChIP-Seq обаче изисква приблизително 20 милиона клетки на реакция, което прави тази техника трудна за използване, когато клетката е ограничена, като изолирани първични клетки и редки клетъчни популации.
Клетките от олигодендроцитна линия, включително олигодендроцитните прогениторни клетки (OPC) и олигодендроцитите, са широко разпространени в мозъка и са от съществено значение за мозъчното развитие и функция. Като тип предшественици, OPC могат да се самовъзобновяват и диференцират. OPCs не само служат като предшественици на олигодендроцитите, но също така играят важна роля в разпространението на невронна сигнализация чрез комуникация с други видове мозъчни клетки 2. Предишни проучвания предполагат, че специфичните за пола транскрипционни фактори като Olig2 и Sox10 3, 4 регулират развитието на олигодендроцитите. Тези транскрипционни фактори са разположени в зоните на организатора или подобрителя, за да свържат някои решаващи гени към тяхната експресия, като същевременно влияят на спецификацията и диференциацията на олигодендроцитите. Трудно е обаче да се идентифицира ДНК-свързващ протеин (или протеинов комплекс) интерес към остро пречистени първични OPC с много ограничен брой клетки.
Този протокол описва как систематично да се изследва геномната ДНК, имунопреципитирана от Olig2 в пречистени OPC на мишки на ниво геном, използвайки техниката ChIP-Seq. OPC на мозъка на мишките се пречистват остро чрез имунопаниране и в експеримент с ChIP без разпространение in vitro. Ограничен брой OPC могат да бъдат получени чрез имунопаниране и е достатъчен за стандартни ChIP-Seq експерименти. Това описва нискоклетъчен протокол ChIP-Seq с едва 20 хиляди клетки на ChIP реакция за транскрипционни фактори. Накратко, омрежените клетки се лизират и обработват с ултразвук от ултразвуково устройство, което срязва хроматин. Срязаният хроматин се инкубира с Olig2 антитяло и покрити с протеин А сфери, за да се утаи свързана с Olig2 антитяло геномна ДНК. След елуиране на зърна, покрити с протеин А и обратно кръстосано свързване, геномната ДНК се утаява с антитела Olig2 и се пречиства чрез фенол-хлороформ екстракция. Полученият продукт беше количествено определен и подложен на T-tailing, превключване и разширяване на шаблона за светене, добавяне на адаптери и армировка, избор на размер на библиотеката и стъпки за почистване за изграждане на библиотека ChIP-Seq.
След секвениране се анализира качеството на суровите отчитания от пробата, приготвена с антитела на транскрипционен фактор Olig2 и контролната проба. Нисши базови двойки и адаптери с четене, че фрагментите са изрязани. След това отрязаните четения бяха подравнени към референтния геном на мишката. Геномните области, които са значително обогатени за отчитане на ChIP, се разпознават като пикове в сравнение с контролната проба. Значителни пикове, представляващи възможни сайтове за свързване на транскрипционен фактор, бяха филтрирани и визуализирани в браузъра на генома.
Методът, описан в този протокол, може да се използва главно за ChIP-Seq от други транскрипционни фактори с всякакъв тип клетки с ограничен брой.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
Всички консумации на животни и експериментални протоколи са извършени в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни и одобрено от Институционалния комитет по биобезопасност и Комитета за хуманно отношение към животните към Здравния научен център на Тексаския университет в Хюстън.
1. Пречистване на PDGFRα положителни клетки на олигодендроцитна линия от мозъка на мишка (модифициран от описаните по-рано имунопаниращи протоколи 5, 6, 7)
(2) Ниско-клетъчна-ChIP подготовка и изграждане на ChIP библиотека за последователност с висока производителност
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
След първоначалната оценка на контрола на качеството, необработеното отчитане и подрязване на адаптерите и проследяването на долните базови двойки са графиките за контрол на качеството на Фигура 4показани. Подрязаните четения трябва да имат базово качество по-голямо от 30, без адаптерни последователности и да имат ниско дублиране (Фигура 4b-Д.). Изрязаното четене с добро качество увеличава общата скорост на подравняване. Други параметри като GC съдържание също са важни и трябва да се имат предвид при подрязването.
Когато се използват сдвоени ChIP-Seq данни, фрагментите се свързват около транскрипционния фактор с определено разстояние на разделяне. Последователността на сдвоени краища позволява по-точна оценка на средната дължина на фрагмента, което дава по-добра оценка на геномните области, където е настъпило повече свързване. Графиката за корелация на нишката показва пикова стойност на обогатяване, която съответства на преобладаващата дължина на фрагмента. Както на фигура 5намерено, изчислената дължина на фрагмента е 130 bp, докато четенето отнема 50 bp. Наборът данни ChIP-Seq, при който дължината на фрагмента е по-дълга от четенето, е показателно за високо качество 16 .
В Silico допълнителните методи към експеримента ChIP-Seq са анализ на обогатяване на мотива и de novo търсене на мотиви. Тъй като свързването на Olig2 в OPCs не е проучвано преди това, произлезлите от Olig2 ChIP-Seq предшестващи клетки от мотониурон на върха и ембрионални стволови клетки са използвани за де ново идентифициране на мотиви 4, 24. Идентифицираните мотиви OLIG2 de Novo бяха добавени към изчерпателната база данни с мотиви ENCODE 25 и беше извършен анализ за обогатяване на мотиви. Високо обогатяване на ново идентифицирани OLIG2 мотиви и известен транскрипционен фактор (HDAC2, SP1, FOXP1, NR3C1, NFKB2/4, SMAD2/3, PAX5 и ASCL1) мотиви бяха открити в ChIP-Seq пикове на PDGFRα пречистени клетки. Обогатяването на 30 de novo идентифицира мотиви с Е-стойност Фигура 7 показва първите два ново идентифицирани мотива на Olig2. Тези два ново идентифицирани мотива на Olig2 са открити в> 60% от PDGFRα пречистени клетки, възстановени от пиковете ChIP-Seq в допълнение към известни мотиви.
Дискусия
След омрежване на пречистените OPC, омрежените клетки трябва да се измият с ледено студен разтвор на HBSS, а останалите етапи от ChIP да се извършат при 4 ° C, в противен случай антитялото не може да утаи правилно геномната ДНК.
Следващата важна стъпка в този протокол е подготовката на библиотеката. PCR амплификацията на ChIP материала е използвана за изграждане на библиотека. Броят на PCR циклите за подготовка на библиотеката зависи от количеството ДНК. Добрата библиотечна подготовка изисква точно определяне на количеството получена ДНК. Твърде много или твърде малко PCR цикли могат да повлияят на концентрацията на библиотеката, както и на сложността, водеща до PCR артефакти.
Трудно е да се изгради библиотека ChIP-Seq, когато имате ограничен брой клетки, които да използвате за имунопреципитация 27. Стандартният протокол ChIP, използван до момента, изисква 10 ng имунопреципитиран DNA-ChIP-Seq библиотечен препарат 1, 28. Обаче протоколът, описан тук, обикновено генерира 2 ng имунопреципитирана ДНК от Olig2 антитела от 20 000 OPC. ДНК се използва за приготвяне на библиотеката ChIP-Seq чрез адаптационен метод в една стъпка, който позволява подобрена чувствителност, позволявайки пикограми от имунопреципитирана ДНК да бъдат усилени. Комбинирайки търговски комплекти, този протокол предоставя практическо решение за извършване на ChIP-Seq за транскрипционни фактори въз основа на малък брой клетки.
Важно е, че описаният протокол за нискоклетъчен ChIP-Seq е приложим за ChIP-Seq и от други транскрипционни фактори в първични клетки или редки клетъчни популации. Антителата, използвани в този протокол, трябва да бъдат проверени експериментално, за да се проведе първо специфичен IP експеримент. Неспецифичното свързване на антителата води до лоши резултати. Освен това се препоръчва да се извърши този нискоклетъчен ChIP-Seq експеримент в клетки с висока експресия на транскрипционния фактор от интерес.
За анализ на данни може да е трудно да се реши кои стойности да се използват като гранични стойности след извикване на пиково филтриране. В зависимост от целта на анализа могат да се използват по-строги или по-спокойни параметри. Обикновено се използва комбинация от обогатяване на отделението и р-стойност или FDR. Ако някои сайтове на свързване на транскрипционен фактор са били известни по-рано в проучване, това може да помогне при определянето на праговете за филтриране. Базите данни на уебсайтове за свързване на транскрипционен фактор от публично достъпни експерименти ChIP-Seq в различни клетъчни линии и условия бяха съставени 29, 30. Човек би могъл да потърси ген и да провери дали местата за свързване на транскрипционен фактор са били открити предварително. Важно е обаче да се знае, че сайтовете за свързване на транскрипционния фактор се различават в зависимост от клетъчните видове и условия.
В Silico допълнителни методи към ChIP-Seq-експеримента са анализ на обогатяване на мотиви и de novo търсене на мотиви с MEME-ChIP 20 или подобни програми. Търсенето на мотиви изисква изчерпателна база данни с мотиви, изведена от de novo. Б. КОДИРАНЕ на мотиви 25 или база данни на Hocomoco 31. Hocomoco е база данни с мотиви, открити от публично достъпни експерименти с хора и мишки ChIP-Seq. Ако мотивите за предполагаемия протеин са неизвестни, търсенето на мотиви de novo може да разкрие повтарящи се последователни модели в значителна част от пиковете като нови мотиви. Комбинаторните опции за действие на транскрипционни фактори могат да бъдат представени, ако се открият и мотиви от други транскрипционни фактори, обогатени в получените пикове.
Обогатените пикови области могат да бъдат валидирани експериментално, като се използва хроматинът на мутиралите или нокаут клетки като контроли. Извършването на ChIP-Seq с клетки, които не изразяват транскрипционния фактор, се използва за идентифициране на фалшиво положителни пикове, наричани също "фантомни пикове" 32. Фалшиво положителните резултати се филтрират.
Също така е интересно да се сравнят получените ChIP-Seq пикове с транскриптомни данни. Пиковете на PDGFRα-Olig2 ChIP-Seq са сравнени с експресията на гени в OPCs от по-ранна публикация 18. Тази стратегия може да бъде ограничена, тъй като механизмите, свързващи експресирани гени в OPC, тъй като транскрипционният фактор на Olig2 могат да бъдат контролирани. В допълнение, транскрипционният фактор на Olig2 може да свързва генна регулаторна област, но генът може да има ниско ниво на генна експресия поради възможни инхибиторни механизми или липсата на кофактори, необходими за генната транскрипция.
ChIP-Seq е метод, използван за идентифициране на общогеномни места за свързване на ДНК за транскрипционни фактори и други протеини. Чрез анализиране на едновременната поява на транскрипционни фактори, изследователите установяват, че транскрипционните фактори са склонни да се свързват с други протеини, образуващи Co Module 33. Това означава, че някои връзки между транскрипционните фактори и геномната ДНК, разкрити от ChIP-Seq, са косвени и се свързват с други протеини. Следователно, за да се получат по-значими резултати, изследователите трябва да изучават множество транскрипционни фактори едновременно.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Разкриване
Авторите заявяват, че нямат финансови конфликти на интереси.