Идентифициране на метаболитно активни бактерии в червата на Spodoptera littoralis

Обобщение

Активната бактериална общност, свързана с червата на Spodoptera littoralis, се определя чрез стабилно изотопно сондиране (SIP), свързано с пиросеквениране. С този метод идентифицирането на метаболитно активните бактериални видове в общността се извършва с висока разделителна способност и точност.

Резюме

Червата на повечето насекоми не са патогенно обитавани от сложни съобщества от симбиотични бактерии. В рамките на тези микробни съобщества е възможно да дойдете или да идентифицирате мутуалистични бактериални видове. Последните са били наблюдавани да изпълняват множество функции на насекомото, като по този начин помагат за размножаването на насекомите, насърчават имунния отговор 2, производството на феромони 3, както и храненето, включително синтеза на основни аминокиселини 4, наред с други.

Поради важността на тези сдружения са положени много усилия за характеризиране на енориите до отделните членове. Повечето от тези усилия се основават или на методи на култивиране, или на генерирането на 16S рРНК генни фрагменти, които са секвенирани за окончателна идентификация. За съжаление, тези подходи се разпознават само при чревните бактериални видове и не предоставят информация за метаболитната активност на микроорганизмите.

За да характеризираме метаболитно активните бактериални видове в червата на насекомо, използвахме стабилно изотопно сондиране (SIP) in vivo, за да приложим 13 С-глюкоза като универсален субстрат. Това е обещаваща техника без култура, която позволява микробните родословия да бъдат свързани с тяхната специфична метаболитна активност. Това е възможно чрез проследяване на стабилни изотопно маркирани атоми от субстрати в микробни биомаркери като ДНК и РНК 5. Включването на 13 С изотопи в ДНК увеличава плътността на маркираната ДНК в сравнение с немаркираната (12 С). В края 13-маркираната ДНК или РНК се отделя от 12-С-немаркираните подобни 6 чрез ултрацентрифугиране с градиент на плътността. Последващият молекулярен анализ на отделените изотополози на нуклеинова киселина установява връзката между метаболитната активност и идентичността на вида.

Тук представяме протокола, използван за характеризиране на метаболитно активните бактерии в червата на насекомото общо (нашата моделна система), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Филогенетичният анализ на ДНК е направен с помощта на пиросеквениране, което позволява висока разделителна способност и точност при идентифициране на чревни бактериални съобщества на насекоми. 13-маркирана глюкоза се използва като основен субстрат в експериментите. Субстратът е хранен с изкуствена диета за насекомите.

Въведение

С появата на PCR-базирани технологии за секвениране, броят на проучванията, използващи чревна биота от множество организми (т.е. хора, насекоми или морски организми) се увеличава. В допълнение, резултатите от изолирането и култивирането на чревни бактерии са независими, отколкото в миналото. Почти 99% от бактериите не могат да бъдат култивирани и е трудно да се симулират условията на околната среда, преобладаващи в червата секвенирани, амплифицирани, клонирани. С тази информация потребителят може да идентифицира бактериалните видове след събиране на информацията за последователността от публични бази данни 13, 14. Независимо от това, секвенирането наближава, за да опише неадекватно бактериалните съобщества поради липсата на информация за метаболитния принос на всеки вид в общността.

Тук използваме 13 С-глюкоза, за да „маркираме“ ДНК на метаболитно активните бактериални видове в червата. Глюкозата е захар, използвана от повечето бактериални видове по широко разпространения път на Entner-Doudoroff (ED), въпреки че са известни изключения 20. Това оправдава използването на 13 С-глюкоза като надеждна метаболитна сонда, която свързва метаболитите от интерес и Източник на въглерод по установени пътища. В зависимост от научния въпрос, други субстрати, т.е. 13 С-метан, 13 CO 2 или растения, отглеждани в атмосфера от 13 CO 2, могат да се използват за справяне с метаболитните дейности.

На този етап представяме протокола, използван при метаболитната характеристика на бактериалната общност в червата на насекомото общо, а именно S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). В допълнение, методът е свързан с пиросеквениране, което от своя страна позволява идентифициране на чревни бактериални съобщества на насекоми с висока разделителна способност и точност. 13-маркирана глюкоза се използва като основен субстрат в експериментите.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

1. Купете или вземете яйца от кладене Spodoptera littoralis от собственото си предприятие за отглеждане. Поддържайте ги в стерилни чашки на Петри при стайна температура (RT) до излюпване.
2. Подгответе изкуственото хранене за отглеждане на насекоми, както следва:
   1. Накиснете 500 г смлян бял боб за една нощ в 100 мл вода.
   2. Добавете 9,0 g аскорбинова киселина и 75 g агар към 1000 ml дестилирана вода и след това кипете.
   3. Оставя се сместа да се охлади и когато се втвърди (до бяла восъчна твърда смес) се съхранява при 4 ° C до употреба.
3. Прехвърлете новоизлюпените ларви в чист пластмасов буркан и ги поставете върху системата за изкуствено хранене при 23-25 ​​° C при дълъг ден с 16-часов режим на осветление и 8 часа тъмнина. Сменяйте храната всеки ден, докато ларвите преминат през всичките шест етапа на ларвите.

2. 13 С-маркиране на ДНК в метаболитно активни чревни бактерии

1. Разтворете 186,1 mg напълно 13-маркирана глюкоза с дестилирана и дейонизирана вода (ddH 2 O) и разбъркайте добре със 100 g изкуствена храна за SIP експеримента. Осигурете крайна концентрация от 13 С-глюкоза от 10 mM в изкуственото хранене. Това имитира in situ концентрацията на глюкоза в червата на ларви на S. littoralis върху памучни растения според Shao et al. (изпратено).
2. Около 9-15 здрави втора ларва от кутията за отглеждане до стерилни пластмасови чаши на Петри (една ларва на чаша Петри) с добавено изкуствено хранене с пресни 13 С-глюкоза. Изкуствено хранене със същото количество естествена глюкоза (12 С-глюкоза), както е описано за хранене на контролната група.
3. Подновявайте изкуственото хранене често по време на инкубационния период (1 ден). Използвайте условия за отглеждане, както в стъпка 1.3.
4. Съберете девет ларви от всяко третиране за по-нататъшна обработка (екстракция на ДНК). Всяка реплика се състои от трима души, като се правят поне три повторения на лечение.

4. ДНК екстракция и амплификация

6. Характеризиране на ДНК чрез пиросеквениране

7. Анализ на данни за пиросеквенция

1. Анализирайте секциите на сурова последователност, генерирани от пиросеквенцията 454, като използвате „Количествени прозрения в микробната екология“, софтуерна тръба QIIME 26. Направете обработката, както следва:
   1. Първо конвертирайте 454 машинно генерирания sff файл във FASTA, QUAL и Flowgram файлове с process_sff.py скрипт.
   2. Потвърдете файла за картографиране (въз основа на check_id_map.py) и присвоява мултиплексни четения на биологични семена с split_libraries.py Сценарий. Нарежете нискокачествените краища с плъзгащ се прозорец с размер 50 и средна качествена граница от 25, дори елиминирайте двусмислени къси последователности (задължителният абонамент е задължителен. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

   Представителни резултати

   След ултрацентрифугиране, след като се потвърди количеството ДНК, отделено във всяка фракция, и се извърши измерването на плътността, нанесете средната плътност на фракцията в g/ml върху броя на фракциите, за да определите правилното образуване на наклон в епруветките, което обикновено включва диапазон на плътност на потвърждение от 1.690 (за фракция 12 или 11) до 1.760 g/ml g/ml (за фракция 1). Количественото пиросеквениране се извършва директно върху представителния градиент на SIP, за да се разкрият видове линии и относително изобилие (Фигура 2 ). Тук ние секвенирахме тежките фракции както от пробата, модифицирана с 13 С-глюкоза, така и от немаркираната контрола, която служи за профилиране на активни популации в общността. След секвенирането бяха генерирани общо 120 045 висококачествени четения със средна дължина 404 нуклеотида. Профилът на пиросеквениране показва повишена честота на някои видове, включително Enterococcus и Pantoea в маркираната проба (13 С-маркирана ДНК, Фиг. 3) в сравнение с контролната група (12 С контролна ДНК, Фигура 3). Следователно бактериите трябва да се считат за метаболитно активни и заслужават по-нататъшно проучване.

   
   1. 13 експеримент за хранене със С-глюкоза, ДНК екстракция и PCR амплификация на 16S рРНК гена Д. (A) 13 C-глюкоза, модифицирано изкуствено хранене, консумирано от ларви на Spodoptera littoralis. (Б) Туземци Глюкозата (12 С-глюкоза) се превръща в изкуствено хранене на ларви от същата партида насекоми (А) използван, който служи като консумиран контрол . (° С) Типичен ДНК екстракт от метагеном от чревната тъкан на ларви в групата за лечение с 13 С-глюкоза и 12 в контролната група С-глюкоза. Във всяка група са включени три биологични повторения (линии 1, 2 и 3). М означава 1 kb ДНК маркер. (Д) PCR амплификацията с универсален набор от бактериални праймери генерира правилните 1,5 kb 16S rRNA генни продукти, използвайки извлечената метагеномна ДНК като шаблон. Линия 1 е PCR положителна контрола. Линия 2 и 3 създават пробата, обработена с 13 С-глюкоза, и контрола на 12 С-захар. jpg "target =" _blank "> Щракнете тук за по-голям изглед.
   
   2. Проектиране на пиро-SIP експеримент с градиент на плътност CsCl ултрацентрифугиране и фракция с пиросеквенираща характеристика на отделената ДНК. H = по-голямо изобилие, L = по-ниско изобилие и изобилие. Щракнете тук за по-голям изглед .
   
   3. Разнообразие от бактерии и относително изобилие в тежките фракции на естествени глюкозно хранени ларви (12 С-контролна ДНК) и 13 С-глюкозно хранени ларви (13 С-маркирана ДНК)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "target =" _blank "> Щракнете тук за по-голям изглед.

   Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

   Дискусия

   Общо описаният тук протокол предоставя прост, бърз и ефективен метод за определяне на метаболитните дейности на чревната флора, който може да се приложи по-нататък за оценка на специфичната роля на симбионтите Bakenrial в храненето, детоксикацията и защитата на гостоприемника.

   Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

   ---