Хранителни компоненти и тяхното влияние върху патогенезата на автоимунния диабет при хора и
TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Катедра по хранителна физиология Хранителни компоненти и тяхното влияние върху патогенезата на автоимунен диабет при хора и мишки Daniela Bettina Müller Пълно копие на докторската дисертация, одобрена от Weihenstephan Science Center for Nutrition, Land Use and Environment в Техническия университет в Мюнхен. Доктор по битови и хранителни науки Председател: Изпитващ дисертацията: Унив.-проф. Д-р J. J. Hauner 1. Унив.-проф. Д-р Х. Даниел 2-ри ап. Проф. Д-р A-G. Ziegler Дисертацията е подадена в Техническия университет в Мюнхен на 5 януари 2010 г. и приета от Научния център за хранене, земеползване и околна среда на Weihenstephan на 25 февруари 2010 г.
За двамата ми дядовци
Съдържание Съдържание 1 Задача. 1-3 2 Въведение и преглед на литературата. 4-23 2.1 Основи на диабет тип 1. 2.1.1 Значението на генетиката. 5-6 2.1.2 Патогенеза и имунологичен фон на диабет тип 1. 6-8 2.2 Пшеница и нейните протеинови фракции. 8-9 2.2.1 Целиакия и връзката между диабет тип 1 и цьолиакия. 10-14 2.2.2 Влияние на пшеничните протеини върху развитието на автоимунен диабет при животински модели. 14 2.2.3 Животински модели на диабет тип 1. 14-15 2.2.4 Влияние на диетичните фактори върху развитието на автоимунен диабет при животински модели. 16 2.3 Краве мляко и неговите протеинови фракции. 17-18 2.3.1 Влияние на протеините от краве мляко върху развитието на автоимунен диабет при животински модели. 18-19 2.4 Влияние на пшеницата и кравето мляко при човешкия диабет тип 1. 19-21 2.5 Асоциация между свързаната с червата имунна система и автоимунния диабет. 21-22 2.6 Други хранителни компоненти и тяхната възможна връзка с диабет тип 1. 22-23 3 Материал и методи. 24-41 3.1 Изследвания върху модела на мишка NOD. 24 3.1.1 Колектив на мишки. 24 3.1.2 Диети. 24-27 3.1.3 Протокол частичен експеримент 1 и 1а. 27-29 3.1.4 Протокол частичен експеримент 2. 29-30 3.1.5 Протокол частичен експеримент 3. 31 I.
Съдържание Съдържание. Списък на фигурите. Списък на таблици. Списък на съкращенията. I-V VI-VIII IX-X XI Предишни публикации. XII автобиография. XIII-XIV благодарност. XV V
Списък на фигури Фиг. 26 Свързване на IAA с мляко, млечни протеини, формули и пшеница в сравнение с човешкия инсулин. 74 Фиг. 27 Криви на свързване на IAA с хранителни компоненти. 75 Фиг. 28 Криви на свързване на IAA с млечни протеини. 76 Фиг. 29 Свързване на IAA с различни млечни протеини в сравнение с инсулина (част 1). 77 Фиг. 30 Свързване на IAA с различни млечни протеини в сравнение с инсулина (част 2). 78 Фиг. 31 Свързване на IAA с различни млечни протеини в сравнение с инсулина (част 3). 79 VIII
Списък на таблици Табл. 20 Анализ на концентрацията на протеин в извлечените хранителни разтвори в различни разреждания и получените средни стойности. 66-67 табл. 21 Характеристики на изследваните лица, чиито IAA се свързват с екстракт от мляко на прах. 73 X
Списък на съкращенията Списък на съкращенията Фиг. Фигура AK Антитела Asp аспарагин cpm радиоактивни разпадания в минута (брои в минута) GAD (A) (антитела срещу) глутамат декарбоксилаза HLA комплекс за хистосъвместимост (човешки левкоцитен антиген) I (A) A Инсулиново (авто) антитяло IA-2 (A ) (Антитела срещу) протеин тирозин фосфатаза IA-2 ICA островни клетъчни антитела Ig имуноглобулин MHC основен комплекс за хистосъвместимост мин. Протоколи n.a. неизвестен NOD недиабетно диабетно RBA анализ на свързване на радиолиганди обороти в минута кръгове в минута T1D диабет тип 1 Таблица TBST Tris буфериран физиологичен разтвор плюс Tween TBT Tris буфериран Tween t-tg тъкан-транглутаминаза vs. срещу СЗО Световната здравна организация ZnT8 Zinc Transporter 8 XI
За да може да се поставят задачи, които биха могли да се разглеждат като потенциални първоначални целеви антигени на IAA. Като цяло тази работа трябва да разработи възможното влияние на отделните хранителни компоненти върху имунния процес на автоимунен диабет. Използвайки данните, получени in vivo върху модела NOD, потенциално диабетогенните хранителни компоненти се тестват върху човешки серуми. Използвайки тези in vitro модели, ще бъде изследвано до каква степен имунните процеси на диабет тип 1 могат първоначално да бъдат предизвикани от кръстосани реакции с хранителни компоненти. Резултатите от тези експерименти биха могли да опишат допълнителни, неизвестни досега механизми на патогенезата на диабета и по този начин да бъдат използвани за разработването на първични терапии за предотвратяване на развитието на диабет тип 1 в ранна детска възраст. 3
Материал и методи (диета D), втора група остана на диета, съдържаща пшеница A, а трета група остана на диета без пшеница B. Женските малки от развъдната група на безглутенова и безказеинова диета C бяха разпределени в тестова група, състояща се от 9 седмична възраст женски животни, останали на диета С (вж. фиг. 4). Размножаващи се двойки Безглутенова, съдържаща казеин диета B Диета без глутен и казеин C Тестови групи Диета B n = 12 Диета A n = 12 Диета D n = 12 Диета C n = 9 Фиг. 4 Разпределение на женските NOD мишки към развъдните и тестовите групи в частичния тест 1. Мъжките млади животни от размножителната група на безглутенова диета В бяха отделени от язовирите след лактация на възраст от три седмици, както е описано за женските животни, и разделени в три тестови групи. Аналогично на груповото разпределение на женските мишки, една от групите получава референтна диета (диета D), втора получава диета, съдържаща пшеница A, а трета група остава на безжитна диета B (виж фиг. 4а). Размножаване на двойки безглутенова, съдържаща казеин диета B Тестови групи Диета B n = 11 Диета A n = 10 Диета D n = 12 Фиг. 4a Разпределение на мъжките мишки NOD към развъдните и тестовите групи в суб-експеримент 1a. 28
Материал и методи За да се отделят протеиновите фракции, съдържащи се в пшеницата, една от друга, беше извършена модифицирана триетапна екстракция В последния етап глутените бяха разделени (Wilson and Goulding 1991, Mimouni et al. 1998, Nicolas et al. 1998 Idris et al. 2003). Екстракция на брашно Албумини и глобулини Центрифугиране> 2x Екстракция на глиадин с екстракция на утайка> 3x Екстракция на глютелинов седимент (N 2 атмосфера) Центрифугиране> 2x Центрифугиране на всички супернатанти Съхранение при утаяване при 18 C Фиг. 7 Схема на екстракция на протеини и отделяне на фракциите от пшенично брашно. 0,1 g търговско пшенично брашно тип 550 се претеглят, добавя се 1 ml буфер на Sörensen (рН 7,35) и сместа се разклаща при 4 ° С в продължение на 20 минути. След центрофугиране (20 минути, 1000 об/мин, Sorvall RC 5B суперскоростна центрофуга) при 4 ° С, супернатантът се отстранява и утайката се екстрахира отново, използвайки същия метод след добавяне на буфер на Sorensen. Двата супернатанта се комбинират и се съхраняват при 4 ° С до завършване на следващите етапи на екстракция. 33
Материали и методи Утаени комплекси от антитела. След центрофугиране 60 μl надстройка бяха отстранени и прехвърлени в нова епруветка. След добавяне на 10 μl анти-човешка IgA агароза в 40 μl TBT буфер към тези епруветки, инкубацията се провежда отново при 4 ° С за един час, докато се разклаща. Това беше последвано от етапите на измиване, описани в точка 3.2.5 за всички епруветки (Протеин-G-Сефароза и IgA-агароза) и измерването в γ-брояча. nd 3.3 Статистика Оценката на кумулативния риск от диабет и честотата на диабета в модела NOD е извършена с помощта на анализи за оцеляване. Тестът за лог-ранг беше използван за сравняване на различните групи в модела NOD. Сравненията на резултатите от инсулина и разпространението на антителата между групите в модела NOD бяха извършени с помощта на непараметричния U-тест на Mann-Whitney. Корелацията между относителното свързване на IAA с пилешки инсулин и афинитетите към IAA беше определена, като се използва корелацията на Spearman. Афинитетът между отделните групи беше сравнен с помощта на U-теста на Mann-Whitney. Във всички анализи стойностите на p