Геноми
Юрген Маркл
12 Институт за молекулярна физиология, Университет Йоханес Гутенберг, Майнц, Германия
Давид Садава
13 Научен център Keck, Claremont, CA, САЩ
Дейвид М. Хилис
14 Тексаският университет в Остин, Остин, Тексас, САЩ
Х. Крейг Хелър
15 Станфордски университет, Станфорд, Калифорния, САЩ
Сали Д. Хакър
16 Държавен университет в Орегон, Корвалис, Орегон, САЩ
Андреас Хелд
Биргит Ярош
7 Jarsoch Text, Аахен, Северен Рейн-Вестфалия Германия
Лотар Зайдлер
Моника Нихаус-Остерлох
Ева Сикст
10 Мюнхен, Байерн Германия
Матиас Делбрюк
Очарователни изследвания: Проектът за кучешки геном
Canis lupus familiis, домашното куче, е опитомено от хората преди около 15 000 години. Въпреки че има много различни разновидности на вълците, те са доста сходни, но това не е така при „най-добрия приятел на човека“. Fédération Cynologique Internationale (FCI), най-голямата чадърна организация в света за развъдчици на кучета, признава над 300 породи кучета. Генетиците предполагат около 100 истински породи кучета, останалите са разновидности. Породите кучета не само изглеждат съвсем различно, но и се различават значително по височина. Например, средното чихуахуа тежи само 1,5 кг, докато шотландската хрътка тежи 70 кг. Никой друг бозайник не показва толкова голяма фенотипна вариабилност. Съществуват и стотици генетични заболявания при кучетата и много от тях имат своите аналози при хората. Проектът за кучешки геном започна в края на 90-те години, за да разбере кои гени са отговорни за генетичната променливост и как гените и болестите са свързани.
Очарователни изследвания: Проектът за кучешки геном
Canis lupus familiis, домашното куче, е опитомено от хората преди около 15 000 години. Въпреки че има много различни разновидности на вълците, те са доста сходни, но това не е така при „най-добрия приятел на човека“. Fédération Cynologique Internationale (FCI), най-голямата чадърна организация в света за развъдчици на кучета, признава над 300 породи кучета. Генетиците предполагат, че има около 100 истински породи кучета, останалите са разновидности. Породите кучета не само изглеждат съвсем различно, но и се различават значително по височина. Например, средното чихуахуа тежи само 1,5 кг, докато шотландската хрътка тежи 70 кг. Никой друг бозайник не показва толкова голяма фенотипна вариабилност. Съществуват и стотици генетични заболявания при кучетата и много от тях имат своите аналози при хората. Проектът за кучешки геном започна в края на 90-те години, за да разбере кои гени са отговорни за генетичната променливост и как гените са свързани със заболявания.
Първите две кучета, чиито геноми бяха напълно секвенирани, бяха боксьор и пудел. ДНК на кучешкия геном се състои от 2,8 милиарда базови двойки в 39 двойки хромозоми. Съдържа 19 000 гени, кодиращи протеини, повечето от които имат аналог при други бозайници, включително хора. Използвайки пълната геномна последователност, те започнаха да картографират генетични маркери - специфични къси ДНК последователности - на определени позиции в генома, които се различават при отделни кучета или породи кучета.
Генетични маркери служат за локализиране (и по този начин идентифициране) на гени, които контролират определени характеристики. Например Илейн Острандер и нейната изследователска група изучават португалски водни кучета, за да идентифицират гени, които контролират размера на тялото. Отстраняването на клетките за изолиране на ДНК беше относително лесно: прокарахте памучен тампон по вътрешната страна на бузата. Генът за инсулиноподобен растежен фактор 1 (IGF-1) се оказа важен при определяне на височината: големите породи имат алел, който кодира активен IGF-1, докато малките породи имат алел носят алел за по-малко активен IGF-1.
Както се очакваше, някои учени основаха компании за тестване на кучета за генетични варианти въз основа на ДНК и по този начин, за да могат да потвърдят „чистотата на породата“ на засегнатите собственици на кучета. По подобен начин е генериран геномът на домашни котки, диви котки и различни големи видове котки. Сравненията на тези животински геноми помагат да се определи еволюционната история на различните линии на бозайници, а също така да се идентифицират гени, които са отговорни за болестите и формите на признаците, както се срещат при различните видове бозайници. Такива изследвания, разбира се, не се ограничават до бозайници, но има геномни проекти в цялото животинско царство, включително растения, гъби, много други еукариоти и множество прокариоти.
Какви знания сме придобили чрез секвениране на геномите на животните?
Отговори на този въпрос ще намерите в „Експеримент: Сравнителен анализ на генома на тигрите“ в раздел 17.1 и в „Изследване на очарованието“ в края на тази глава.
Геномите вече могат да бъдат секвенирани много бързо
В Последователност на генома определя се нуклеотидната последователност на целия геном на живо същество. При прокариот, който има единична хромозома, геномната последователност е непрекъсната последователност от базови двойки (bp). В диплоиден, сексуално размножаващ се вид с множество автозоми и двойка полови хромозоми (раздел 10.1007/978-3-662-58172-8_12 # Sec22) терминът "секвениран геном" обикновено се отнася до последователността на всички основи в хаплоид Автозомен набор и двете полови хромозоми (при хора 22 + 2, при кучета 38 + 2).
Накратко
Геномите са секвенирани под формата на къси фрагменти, които се картографират един към друг с помощта на припокривания.
Във функционалната геномика информацията за последователността се използва за определяне на функциите на различните части на генома.
В сравнителната геномика се сравняват геномните последователности на различни организми.
С напредъка в технологията за секвениране на ДНК се наблюдава експлозия на генетична информация, която учените могат да използват по различни начини.
Може да се сравнят геномите на различни видове, за да се види как те се различават на ниво ДНК. След това тази информация може да се използва за разбиране на еволюционните взаимоотношения.
Може да се сравнят последователностите на индивидите в даден вид, за да се идентифицират мутации, които причиняват определени фенотипове.
Информацията за последователността може да се използва за идентифициране на гени за определени типове черти, като гени, свързани с болести.
Може да се намери ДНК последователността на кодиращите протеини гени и от това може да се изведе аминокиселинната последователност на съответните протеини, ако това все още е неизвестно.
Базовата последователност на къс ДНК фрагмент може да бъде определена бързо
Способността да се секвенира целият геном на сложен организъм дори не се е обмисляла преди 1986 г. Нобеловият лауреат Ренато Дълбеко обаче и други учени предложиха по това време научната общност по целия свят да бъде мобилизирана, за да се справи с последователността на целия човешки геном. Една от причините беше, че хората, преживели атомната бомбардировка в Япония по време на Втората световна война и които са били изложени на радиация, трябва да бъдат изследвани за евентуални увреждания на ДНК. Въпреки това, за да може да се определят промените в човешкия геном, първо трябва да се знае неговата последователност.
Така че беше финансирано с публични пари Проект за човешкия геном стартира, огромно начинание, което беше успешно завършено през 2003 г. - значително по-рано от очакваното. Тези усилия бяха подкрепени и допълнени от частно финансирани групи. Проектът се възползва от разработването на много нови и новаторски методи, които за първи път бяха приложени към секвенирането на по-малки геноми - от прокариоти и просто изградени еукариоти, като моделните организми, с които сте се сблъсквали в предишните глави на тази книга. Много от тези методи се използват широко днес, включително изцяло нови методи, специално за секвениране на генома. Методологичните разработки в този сектор продължават. Тези методи се допълват от нови методи за изследване на фенотипното разнообразие на протеини и метаболитни продукти в клетката. Основно изискване беше и е драматичното по-нататъшно развитие на компютърния хардуер и софтуер, за да може да се справи с огромното количество данни, които възникват.
Много прокариоти имат една хромозома, докато еукариотите имат много хромозоми. Поради различните си размери, хромозомите могат лесно да бъдат отделени една от друга. Изглежда, че най-ясният метод е да се започне секвениране на хромозома в единия край и просто да се секвенира цялата нуклеотидна молекула на ДНК от нуклеотид. Задачата е донякъде опростена от факта, че само една от двете нишки трябва да бъде секвенирана, тъй като другата се допълва. Погледнете последователността
тогава другата нишка трябва да изглежда така:
Въпреки това, дори и при днешните методи, последователността на ДНК молекула, която е дълга милиони базови двойки от единия до другия край, не е възможна и също не е необходима. С тази стратегия могат да се секвенират най-много няколко хиляди базови двойки наведнъж. За да се определи последователност на генома, дългата няколко сантиметра ДНК нишка на хромозомата трябва да се раздели на много къси ДНК фрагменти и след това хиляди такива фрагменти се секвенират едновременно.
През 70-те години Фредерик Сангер и колегите му изобретяват метод, чрез който ДНК може да бъде секвенирана с помощта на химически модифицирани нуклеотиди. Тези нуклеотиди първоначално са проектирани да спрат раковите клетки да се делят. Този метод (или негов вариант) е бил използван за определяне на първата геномна последователност на хора и няколко моделни организми. Според днешните стандарти обаче методът е относително бавен, скъп и трудоемък. През първото десетилетие на новото хилядолетие бяха разработени по-бързи и евтини методи, често наричани Последователност с висока производителност обобщава. Тези методи използват миниатюризирана техника, първоначално разработена за електронната индустрия и механизмите на репликация на ДНК, често в комбинация с Полимеразна верижна реакция (PCR).
Препратка
PCR може да бъде автоматизиран; това е важен метод за секвениране на малки количества ДНК. Подробности за PCR можете да намерите в раздел 10.1007/978-3-662-58172-8_13 # Sec23.
Методите за последователност с висока производителност, също обобщени под термина Последователност от следващо поколение (NGS), бързо се подобряват. Тук е очертан един от многото подходи и е показан на фиг. 17.1. Първо, ДНК фрагментите се подготвят за секвениране чрез свързването им към твърда подложка и амплифицирането на ДНК чрез PCR (фиг. 17.1 а):
Голяма ДНК молекула се разделя на къси фрагменти с около 100 bp всеки. Това може да стане физически чрез създаване на механични сили на срязване, които разбиват ДНК. Или се използват ензими, които хидролизират фосфодиестерните връзки между нуклеотидите в ДНК скелета на определени интервали.
ДНК се денатурира от топлина, разрушавайки водородните връзки, които държат двете вериги заедно. След това всяка единична верига действа като шаблон за синтеза на нова, допълваща се ДНК.
Кратки синтетични олигонуклеотиди са прикрепени към краищата на всеки фрагмент и те са прикрепени към твърда подложка.
ДНК фрагментите се амплифицират чрез PCR. Използват се праймери, които допълват синтетичните олигонуклеотиди в краищата на отделните ДНК фрагменти. Тъй като към всяка позиция са прикрепени около 1000 копия на ДНК, новодобавените нуклеотиди могат лесно да бъдат открити по време на етапите на секвениране.