Еволюционни промени в употребата на редокс-активни аминокиселини и техните причини - PDF Free
Еволюционни промени в употребата на редокс-активни аминокиселини и техните причини Еволюционна променливост при използването на аминокиселини RedoxActive: Причини и последствия За получаване на степен доктор по естествени науки в Биологическия факултет на Университета Йоханес Гутенберг в Майнц, представена от Марио Шинделдекер геб. на 20 декември 1978 г. в Родалбен а.д. Родалб Майнц, 2014
Декан: 1-ви рецензент: 2-ри рецензент: Ден на устния изпит: 03.06.2015
Съдържание Списък на съкращенията. IV 1 Въведение. 1 1.1 Оксидативен стрес. 1 1.2 Митохондрии. 1 1.2.1 Структура и функция. 2 1.2.2 Митохондриална дихателна верига и окислително фосфорилиране. 4 1.2.3 Отклонения от универсалния генетичен код. 11 1.3 Теория за стареенето на свободните радикали. 12 1.3.1 Реактивни кислородни видове. 12 1.3.2 Митохондриална теория за стареенето на свободните радикали. 14 2 Проблеми и цели. 17 3 материал. 18 3.1 Записи на белтъчни данни. 18 3.1.1 Продължителност на живота, телесна маса и протеинови последователности на изследвани животински видове. 18 3.1.2 Човешки протеинови последователности на отделни отделения. 20 3.1.3 Ядрени и митохондриално кодирани субединици на комплексите на дихателната верига. 21 3.2 Компютърни програми и софтуерни пакети. 21 3.3 Специални химикали. 21 3.4 Списък на устройствата. 22 3.5 Клетъчна култура. 23 3.5.1 Клонални клетки. 23 3.5.2 Първични клетки. 23 3.6 Медии и решения за клетъчна култура. 23 3.7 Разтвори за биохимични и клетъчни биологични анализи. 24 3.8 Буфери и разтвори за анализ на протеини и липиди. 24 3.9 Антитела. 27 4 Методи. 29 4.1 Биоинформатични анализи. 29 4.1.1 Честота на използване на аминокиселини в протеинови последователности. 29 4.1.2 Идентифициране на мембранните области. 29 4.2 Клетъчна култура. 29 4.2.1 Определяне на клетъчната възраст на IMR90 клетките. 29 I.
Списък на съкращенията 2SH меркаптоетанол 4SH 1-бутантиол 8SH 1-octanethiol 10SH 1-decanethiol 12SH 1-додекантиол 14SH 1-tetradecanethiol 18SH 1-octadecanethiol ABAM смесват антибиотик противогъбично смес амониев амониев киселина, амониев-противогъбично смес AChE Ацетилхолинестеразата АА catalanethiol AChE, ацетилхолин Triphase, AChE, ацетилхолин Triphase, AChE, catalosulphase, AChE, ацетилхолин Triphase, AChE, catalosulphase, Aosphdenic киселина, AAC, А, С, С, С, А, С, С, С, М, А, В, А, В, С, D, С, С, М и С, А, С, С, С, D, C, D, С, С, С, D, С, С, D, 8, 5, 5, 5 и 5 каталаза CYS цистеин ddH2O двойно дестилирана вода на модифицирана среда на Eagle DMS Dodecylmethylsulfid DMSO диметилсулфоксид ДНК 3-меркаптопропионова киселина DHA докозахексаенова киселина DMEM на Dulbecco дезоксирибонуклеинова киселина DOH 1-додеканол DPBS на Dulbecco фосфатен буферен физиологичен разтвор CstF стимулиране разцепване фактор DTT дитиотреитол EDTA етилендиаминтетраоцетна ER ендоплазмения ретикулум трансфер ETF електрон пръстен флавопротеин EtOH етанол FBS/FCS фетален говежди/телешки серум, фетален говежди серум FMN флавин мононуклеотид GRase глутатион редуктаза IV
GSH глутатион GPX глутатион пероксидаза h часа (и), час (и) H2O2 водороден пероксид HRP хрян пероксидаза, хрян пероксидаза MAM митохондрии свързана ER мембрана MEM NEAA Минимална есенциална средна, несъществени аминокиселини MTS митохондриална минута насочване Митохондриална минута насочване Митохондриална минимална мишена mtdna Митохондриална дезоксирибонуклеинова киселина Msr метионин сулфоксид редуктаза MTT 3- (4,5-диметилтиазолил-2) -2,5-дифенилтетразолиев бромид MUFA (s) мононенаситени мастни киселини, мононенаситени мастни киселини (n) mm миликумол µ mw миливен NADPH Никотинамид аденин динуклеотид фосфат NOX NADPH оксидаза NaN3 натриев азид nm нанометър Oxa1 митохондриална оксидаза събрание протеин 1 PAGE полиакриламиден гел електрофореза PD удвояване PUFA (s) полиненаситена мастна киселина (и), стайна температура полинуклеозид Ricum Ricul Ricol Ricol Ricol Ricol Ricol Ricol Ricol Ricol Ricol Ricol Ricol реактивни кислородни видове, реактивен Sa ustoffspies SDS натриев додецил сулфат, натриев додецил сулфат SOD супероксид дисмутаза SRP разпознаване на сигнала частица V
t12sh tert-dodecanethiol TBARS тиобарбитурова киселина реактивни вещества, тиобарбитурова киселина реагиращи вещества TEMED N, N, N ', N'-тетраметилетилендиамин TFA транс мастни киселини, транс мастни киселини TM трансмембранен TOC α-токоферол, витамин E TOM транслока на транслока на външната мембрана trna Тиоредоксин TWEEN полисорбат VDAC зависим от напрежението анионен канал VI
Въведение Фигура 5: Преглед на реакциите на реактивните кислородни видове и нитровидовете в митохондрията и нейните последици. Адаптиран от Smith et al., 2003. Токсичността на супероксида в митохондриалната матрица може да бъде изследвана при митохондриални нокаутиращи мишки Mn-SOD, които оцеляват само между 10 и 20 дни дори в присъствието на антиоксиданти (Lebovitz et al., 1996; Li et al., 1995). За разлика от това, нокаутът на цитозолен Cu/Zn-SOD не е летален, въпреки че тези животни показват леко повишена чувствителност към ROS (Ho et al., 1998), което предполага, че екстрамитохондриалният супероксид е по-малко токсичен. Характеристика на натрупването през целия живот на протеини и липиди, увредени от окисляването, е строго зависимата от възрастта поява на липофусцин, неразградимо съхранение на липофилни, агрегирани протеини (30-58%) и липиди (1951%) в постмитотични клетки (Porta, 2002). Липофусцин се среща особено силно в сърдечния мускул и нервните клетки, както и в пигментния епител на ретината. В обобщение, тази теория може да се използва за обяснение на прогресивния ход на стареенето, както следва: В хода на стареенето окислените протеини постоянно се натрупват. Окислението на 16
Материал 5 ml пируват (100 mm) 5 ml MEM NEAA (100 mm) 3.7 Разтвори за биохимични и клетъчни биологични анализи MTT разтвор (3- (4,5-диметилтиазолил-2) -2,5-дифенилтетразолиев бромид: 5 mg/ml MTT в ddh2o MTT разтвор за разтваряне: 40% (w/v) диметилформамид 10% (w/v) натриев додецил сулфат pH 4.0 (ледена оцетна киселина) 3.8 буфери и разтвори за анализ на протеини или липиди 10x фосфатен буферен разтвор (PBS): 1,37 M NaCl 27 mm KCl 100 mm Na2HPO4 x H2O 18 mm KH2PO4 ph 7.4 Буфериран с фосфат физиологичен разтвор с TWEEN-20 (PBS-T): 1x PBS 0,05% (v/v) TWEEN-20 ph 7.4 Буфер за клетъчна реколта (лизисен буфер) без SDS: 24
Материал 50 mm Tris-HCl 10% захароза 1 mm EDTA 1 mm EGTA 15 mm HEPES 1 mm натриев ортованадат 1 mm NaF протеиназен инхибитор 1: 100 (Sigma-Aldrich) фосфатазен инхибитор 1: 100 (Sigma-Aldrich) ph 6.8 4x зареждащ буфер (Пробен буфер) за SDS-PAGE: 200 mm Tris-HCl, ph 6.8 8% (w/v) SDS 40% (w/v) глицерол 0.02% (w/v) бромофенол синьо 20% (v/v) β-меркаптоетанол 10x работещ буфер за SDS-PAGE: 250 mm Tris основа 2,5 M глицин 1% (w/v) SDS pH 8,3 отделящ гел за SDS-PAGE: 0,375 M Tris-HCl, pH 8, 8 10% (w/v) акриламид/бисакриламид (29: 1) 0,1% (w/v) SDS 0,05% (v/v) TEMED 25
Материал 0,1% (w/v) APS гел за подреждане за SDS-PAGE: 0,15 M Tris-HCl, pH 6,8 3% (w/v) акриламид/бисакриламид (29: 1) 0,1% ( w/v) SDS 0,05% (v/v) TEMED 0,1% (w/v) APS 10x трансферен буфер: 250 mm Tris основа 2,5 M глицин Добавяне на 20% метанол към 1x разреждане 1x Ponceau S.: 0,2% (w/v) Ponceau S 5% (v/v) оцетен киселинен блокиращ буфер: 5% (w/v) сухо мляко на прах (без мазнини) в PBS-T Нередуциращ липиден буфер (дегазиран): 20 mm TRIS, ph 7,4 1 mm MgCl2 5 mm KCl 26
Материален буфер за анализ на мастните киселини: 1x PBS 10 µm фенотиазин 1 mm DTT 1 mm EDTA Разтворители на луминол: A: 0,1 M Tris-HCl, pH 8,6 0,025% луминол B: 0,11% пара-кумарова киселина в DMSO C: 30% H2O2 TBARS анализ Стоп разтвор: 5% трихлороцетна киселина в 1 М ледена оцетна киселина 0,5% тиобарбитурова киселина в 10 mm NaOH 3.9 Антитела Използваните антитела се разреждат в PBS-T до концентрациите, дадени по-долу. Освен това към първичните антитела се добавя 0,05% натриев азид (NaN3). Производител на антитела анти-hsp70 (1: 1000) стрес ген, САЩ анти-hsp90 (1: 1000) стрес ген, САЩ анти-p21 (1: 500) BD Biosciences, САЩ анти-p53 (1: 1000) Abcam, САЩ анти-p62 (1: 500) Санта Круз Биотехнология, САЩ анти-полиубиквитин (1: 1000) Dako, Дания антитубулин (1: 1000) Sigma-Aldrich, Германия Таблица 6: Първични антитела 27
Производител на материални антитела Esel anti-mouse-hrp (1: 10000) (Dianova) Jackson ImmunoResearch, САЩ Esel anti-rabbit-hrp (1: 10000) (Dianova) Jackson ImmunoResearch, USA Таблица 7: Вторични конюгати антитяло-HRP 28
Резултати Фигура 7: Съотношения на разпределението на аминокиселините между пероксизомни и клетъчни протеини при 4 вида (отляво надясно: Homo sapiens, Bos taurus, Mus musculus, Rattus norvegicus). 5.1.2 Сравнение на митохондриални и клетъчни протеини Съотношението на използване на аминокиселини в митохондриално кодирани протеини в сравнение с клетъчни протеини и митохондриално кодирани протеини в сравнение с митохондриално локализирани протеини служи като модел два и три (Фигура 8 и Фигура 9). Някои особености на митохондрията са, че тя се счита за основно място за производство на окислителни кислородни видове (Brand, 2010) и че в митохондриално кодираните протеини от комплекс I редокс-активната аминокиселина цистеин се изчерпва в зависимост от продължителността на живота (Schindeldecker et al., 2011), докато това Редокс-активният метионин също се обогатява там, независимо от максималната продължителност на живота (Bender et al., 2008). Това прави митохондрията виден модел, върху който могат да се изследват еволюционните адаптации към оксидативния стрес и произтичащата от това диференцирана честота на използване на аминокиселини. 39
Резултати Използвайте KLMNPQRSTVWY Аеробност (V) 1,39 1,01 1,51 1,16 1,63 1,77 1,04 0,93 1,68 0,58 1,03 0,68 5E-05 6E-01 2E -06 1E-02 5E-09 9E-12 2E-01 5E-05 1E-09 3E-12 6E-01 2E-11 Таблица 12: Модел V: Честота на използване на аминокиселини в кодирани в митохондриите протеини на дихателната верига при свободен живот, аеробни срещу паразитни, анаеробни хелминти. (еднопосочен, непараметричен дисперсионен анализ с две категории). * Терминът дажба описва съотношението на средните стойности. Ако се сравни диференцираното използване на аминокиселини в митохондриално кодираните протеини на дихателната верига между аеробни и анаеробни червеи, забележимо е, че цистеинът показва най-голяма средна промяна под формата на изчерпване (Таблица 12). Най-голямо значение обаче има хистидинът, който поради това се дължи на ниското разсейване на точките с данни. Честотата на използване на метионин, от друга страна, показва голямо разсейване в изследваните животински видове, което, комбинирано с високо средно отклонение, осигурява средно статистическо значение. Тъй като разсейването на аминокиселината валин е малко, това води до най-значителна промяна в този модел. 49
Резултати от окисляем субстрат, който инхибира или забавя окисляването му (Halliwell, 1990). Трябва да се отбележи, че в допълнение към окисляемите аминокиселини, захарта, ДНК и липидите също могат да служат като субстрати. Фактът, че метионинът се натрупва особено в протеините на вътрешната митохондриална мембрана, е особено интересен, което се дължи биологично на наличието на два метионинови кодона в митохондриално кодираните протеини на дихателната верига. Предполага се, че натрупването на метионин в тези протеини и свързаното с него удвояване на метиониновия кодон в митохондриалната ДНК е причинно-следствена поради производството и увеличената поява на ROS в тази органела или отделение (Bender et al ., 2008). Следователно беше от интерес да се изследва употребата на метионин в различни отделения или области на човешката клетка, за да се определи дали може да се намери топологично специфична честота при използването на тази аминокиселина. В резултат на това човешките протеинови последователности от различни субклетъчни области бяха анализирани за тяхното съдържание на метионин. 52
Резултати 5.2.1 Сравнение на употребата на метионин в различни субклетъчни области Фигура 10: Използване на метионин в човешки протеини в различни субклетъчни области. Всяка вертикална линия символизира отделен протеин, чието положение съответства на степента на използване на метионин в кривата на разпределение, показана по-долу. Зелените линии означават съответната средна стойност, а червените линии за съответната медиана на употребата на метионин в изследваните отделения. Непрекъснатата вертикална линия маркира глобалната медиана на всички протеинови последователности, изследвани през 19806. Фигура 10 показва статистическото разпределение на метионин в човешки протеини в различни субклетъчни области. Следните съкращения са използвани на фигура 10 и в таблица 14 53
Резултати Сравнението на четирите дихателни комплекса вериги I, III, IV и V, при които субединиците идват както от ядрото, така и от самия митохондрий, също показва различна честота на използване на метионин. Средно комплекс I се състои от 5,84% метионин при всички изследвани животински видове, 2,64% при животни с един Met кодон и 6,82% метионин при животни с два Met кодони; Комплекс III във всички от 3,79% метионин, при животни с един Met кодон от 2,30% и при животни с два Met кодона от 4,24% метионин. Комплекс IV във всички от 4,72%, при животни с един Met кодон от 3,42% и при животни с два Met кодона от 5,11% метионин; Комплекс V при всички животински видове от 5,31%, при животни с един Met кодон от 3,17% и при животни с два Met кодона от 5,97% метионин. Най-голямата разлика в различните комплекси може да се наблюдава в комплекс I. Има разлика в честотата на използване на метионин от 4,18% между животни с един Met кодон и животни с два Met кодони. 60
Резултати Фигура 12: Скорост на оцеляване на HT22 клетки след инкубация с 1 µm, 2 µm, 5 µm, 10 µm, 20 µm, 50 µm, 100 µm и 200 µm CAM, DES, CYS и GSH за 72h (n> = 3). Водоразтворимите вещества CAM, DES, CYS и GSH, използвани на фигура 12, не показват токсичен ефект върху клетки HT22 при никоя от концентрациите, използвани след инкубация в продължение на 72 часа. Фигура 13: Скорост на оцеляване на HT22 клетки след инкубация с 1 µm, 2 µm, 5 µm, 10 µm, 20 µm, 50 µm, 100 µm и 200 µm 2SH, 4SH, 8SH и 12SH за 72h (n> = 3). След 72 часа инкубация на НТ22 клетки с липофилните вещества 2SH, 4SH, 8SH и 12SH, беше установена диференцирана токсичност. С увеличаване на концентрацията токсичността на всички вещества се увеличава. Токсичният ефект е най-силно изразен при 12SH, след това при 8SH, 4SH и 2SH. По този начин токсичността корелира с дължината на алкиловата верига и концентрацията на 62
Резултати, концентрацията не повлиява токсичния ефект. Само CAM показва ниска концентрация-зависима токсичност след 72 часа. Фигура 15: Преживяване на клетките на IMR90 клетки (PD 28.1) след 72 часа инкубация с 1 µm, 2 µm, 5 µm, 10 µm, 20 µm, 50 µm, 100 µm и 200 µm 2SH, 4SH и 8SH (n> = 3 ). След 72 часа лечение на IMR90 клетките с нарастващите липофилни вещества 2SH, 4SH и 8SH, също имаше ниско ниво на токсичност (Фигура 15). Нито едно от трите приложени вещества не показва ясни дозозависими ефекти. Фигура 16: Скорост на оцеляване на IMR90 клетки (PD 28.1) след 72 h инкубация с 1 µm, 2 µm, 5 µm, 10 µm, 20 µm, 50 µm, 100 µm и 200 µm 10SH, 12SH, 14SH (n> = 3 ). Степента на преживяемост на IMR90 клетки, третирани с 10SH, 12SH и 14SH за 72 h, се е увеличила с 64