Експресия на клетъчния инхибитор на апоптоза протеин-2 в човешки подкожни и

  • абстрактно
  • Въведение
  • Методи
  • Субекти и вземане на проби
  • Приготвяне на РНК и RT-PCR
  • Изолация на протеини и анализ на Western Blot
  • Откриване на апоптоза
  • Статистически анализ
  • Резултати
  • дискусия
  • Денят на благодарността

абстрактно

ЦЕЛ: В присъства В това проучване се занимавахме с въпроса дали има депо-специфична експресия на клетъчния инхибитор на апоптоза протеин-2 (cIAP2) още в детството и дали относителната експресия се променя с увеличаване на възрастта с увеличаване на риска от висцерално затлъстяване.

Теми: 23 пациенти (12 деца и 11 възрастни) получени сдвоени проби от човешка мастна тъкан (OM) и подкожна мастна тъкан (SC).

МЕТОД: нивата на cIAP2 иРНК се определят, като се използва полимеразна верижна реакция с обратна транскрипция (RT-PCR) и протеинова експресия, потвърдена от Western blot. Индексите на апоптоза се определят чрез терминиране на деоксинуклеотидил трансфераза-медиирано dUTP флуоресцеиново маркиране (TUNEL).

РЕЗУЛТАТИ : иРНК на cIAP2 е 1,51 пъти по-висока в OM, отколкото в SC мастна тъкан (OM> SC при 20 от 23 субекта; P SC при девет от 10 субекта, P 1

Затлъстяването се характеризира с увеличаване на масата на мастната тъкан. Масата на телесните мазнини, особено натрупването на висцерални мазнини, е тясно свързана с инсулинова резистентност, сърдечно-съдови заболявания, високо кръвно налягане и други сериозни метаболитни нарушения. 2 Това показа важността на идентифицирането на генетични фактори, които регулират не само масата на мазнините, но и разпределението на мазнините.

Известно е, че оменталните (OM) и подкожните адипоцити (SC) се различават по различни метаболитни свойства, които регулират обема на мастните клетки. 3, 4 Репликацията, диференциацията и апоптотичният отговор на човешките мастни клетки изглежда са повлияни от анатомичния регион. 5, 6. Следователно разпределението на мастната тъкан може да се отдаде на специфичните за мястото разлики в регулирането на тези процеси. Наскоро беше показано, че регионалните характеристики могат да бъдат свързани със специфичните за мястото различия в експресията на гени, които кодират важни функционални протеини. 7 Например, експресията на лептин и PPAR y е по-висока в SC, отколкото в OM мастната тъкан. 8, 9 За разлика от тях, експресията на инсулиновия рецептор (Пример 11-) е по-висока в ОМ, отколкото в SC мастната тъкан. 9

Клетъчният апоптозен протеин-2 инхибитор (cIAP2) принадлежи към семейството на апоптозния протеин (IAP), който участва в регулирането на апоптозата по време на клетъчната пролиферация и диференциация. 10, 11, 12 Ролята на IAP в човешката мастна тъкан не е ясна, но все повече доказателства предполагат, че те могат да играят роля в регулирането на разпределението на телесните мазнини чрез модулация на апоптозата на мастните клетки. Един доклад показва, че зависимата от диференциацията експресия на инхибиторния протеин на невроналната апоптоза (NAIP) в 3T3-L1 адипоцитите може да корелира с развитието на резистентност към адипоцити към апоптоза. Две други проучвания съобщават, че cIAP2 иРНК е специфично депо експресирана в мастните клетки на възрастни хора. 14, 15

Досега изследванията върху разликите в генната експресия се фокусираха върху възрастните. Много малко се знае за специфичната за сайта експресия на гени в мастната тъкан при деца. Тъй като съществуват зависими от възрастта разлики по отношение на масата и разпределението в човешката мастна тъкан, ние се справихме с въпроса дали има специфична за депо експресия на cIAP2 още в детството и ако да, дали относителната експресия се променя с увеличаване на възрастта Затлъстяване. Поради това в настоящото проучване ние сравнихме нивата на експресия на cIAP2 както при иРНК, така и при ниво на протеин в OM и SC мастната тъкан на деца и възрастни. Освен това изследвахме връзката между нивото на експресия на cIAP2 и скоростта на аподитоза на адипоцитите, индекса на телесна маса (ИТМ) и пола.

Методи

Субекти и вземане на проби

Приготвяне на РНК и RT-PCR

Нивата на тРНК на cIAP2 бяха определени при всички субекти, при които общата РНК беше достъпна както от SC, така и от OM мастна тъкан. Общата РНК се приготвя, като се използва реагентът TRIzol (Invitrogen Life Technologies, CA, USA) съгласно протокола на производителя. РНК се определя количествено спектрофотометрично. Целостта на РНК се проверява чрез оцветяване с етидиев бромид на рибозомни РНК ленти с използване на 1% агарозен гел. Получената РНК се съхранява при -70 ° С, докато се използва.

RT-PCR се извършва за анализ на cIAP2 иРНК. Общата РНК (0,5 × 1 μg) се екстрахира за 1 час при 42 ° С в 20 μl буфер, съдържащ 200 U MMLV обратна транскриптаза, 0,5 μg олиго d (Т) 16, 0,5 mmol/l dNTP, 20 U RNase инхибитор, обратна транскрипция. Допълнителни ДНК (cDNA) проби се денатурират в продължение на 5 минути при 95 ° C. и 5 μl cDNA от всяка проба се използват за последваща PCR амплификация в краен обем от 50 μl буфер, съдържащ 2.5 U Taq ДНК полимераза, 0, 2 mmol/L, съдържа dNTP, 2,5 mmol/L MgCl2 и 0,4 μmol/L от всеки грунд. Условията за PCR бяха 95 ° С за 5 минути, последвани от 30 цикъла от 94 ° С за 30 секунди, 60 ° С за 45 секунди и 72 ° С за 1 минута и накрая удължаване от 72 ° С за допълнителни 10 минути. Реактивите за RT са доставени от Promega Corp. (Медисън, САЩ). Реагентите за PCR бяха от Roche (Манхайм, Германия). В тази полуколичествена RT-PCR се използват едновременно два набора праймери (Таблица 1). Използван е различен брой PCR цикли, за да се гарантира, че амплификацията както на cIAP2, така и на β-актиновата cDNA е в експоненциалния диапазон. Праймерите за β-актин бяха добавени в шестия цикъл на всяка PCR амплификация.

След усилване, 10 цт. 1 от сместа се отделя върху 1,5% агарозен гел, оцветен с етидиев бромид. Геловете се визуализират под UV светлина, плътността и съотношението на cIAP2 към β-актин се измерват и анализират с помощта на софтуера за количествено определяне, версия 4 Windows и Macintosh (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Изолация на протеини и анализ на Western Blot

Откриване на апоптоза

Апоптотични адипоцити в 15 сдвоени проби бяха открити чрез терминално деоксинуклеотидилтрансферазно медиирано dUTP флуоресцеиново етикетиране (TUNEL) съгласно протокола на производителя. Апоптотичните индекси са получени чрез преброяване на 200 адипоцити в поне четири зрителни полета под светлинен микроскоп.

Статистически анализ

Данните бяха анализирани с помощта на Статистическия пакет за социални науки (SPSS) и стойността на P по-малка от 0,05 придаде значимост. Тъй като експресията на cIAP2 обикновено не се разпределя в мастната тъкан, тя е показана в текста и таблицата като медиана (интерквартилен диапазон). Тестът за ранг, подписан от Уилкоксън, се използва за сравняване на експресионните разлики между SC и OM; Тестът на Ман-Уитни е използван за сравняване на специфичните за депо разлики между деца и възрастни. Корелациите са изчислени с помощта на теста на коефициента на корелация на Spearman.

Резултати

Сравненията по двойки на cIAP2 иРНК експресия от SC и OM мастна тъкан бяха количествено определени чрез RT-PCR, както е показано на Фигура 1а. Имаше забележими вариации в нивото на експресия между индивидите, особено при ОМ (1b). Независимо от това, имаше значителна депо-специфична разлика в нивото на експресия на cIAP2 mRNA (Таблица 2). иРНК на cIAP2 е 1,51 пъти по-висока в OM, отколкото в SC мастната тъкан (OM> SC при 20 от 23 субекта; P.

експресия

Депо-специфични разлики в mRNA експресията на cIAP2. (а) Пример за анализ на агарозен гел след RT-PCR на сдвоени проби от SC и OM мастна тъкан от пет индивида. (b) Scatterplots показват, че експресията на cIAP2 иРНК присъства в SC и OM мазнини от всички индивиди. Хоризонталните ленти показват средната стойност.

Western blots са показани на ФИГ. В съгласие с експресията на mRNA, съдържанието на протеин cIAP2 е по-високо в OM, отколкото в SC (OM> SC при девет от 10 субекта, P.

инхибитор

Депо-специфични разлики в експресията на протеин на cIAP2. (а) Пример за имуноблоти на cIAP2 протеини от SC и OM мастна тъкан от четири индивида. (b) Scatterplots показват експресия на протеин cIAP2 в SC и OM мазнини от 10 индивида. Хоризонталните ленти показват средната стойност.

Имунохистохимичният анализ не показва разлика между SC и OM в апоптотичните индекси на адипоцитите (апоптотични индекси 14, които показват по-висока експресия на mRNA на cIAP2 в OM от адипоцитите на SC при възрастни. Същите автори също показват, че експресията на cIAP2 mRNA в човешките преадипоцити на ОМ е по-висок от този на SC мазнините.15 Въпреки това, тяхното изследване се фокусира само върху нивата на иРНК.Тъй като експресията на иРНК не винаги отразява експресията на протеин или концентрацията на напълно обработен протеин, ние разширихме наблюдението чрез потвърдихме, че основната разлика между ОМ и SC мастната тъкан също се среща на ниво протеин.

Първоначално cIAP2 е идентифициран като протеин, свързан с TNF-α рецепторния сигнален комплекс, което предполага, че може да участва в регулирането на TNF-α сигнализиране. 16 Свръхекспресията на човешкия протеин cIAP2 може да потисне клетъчната смърт, предизвикана от различни стимули. В сравнение с изолирани от човека адипоцити, преадипоцитите, култивирани в серум-съдържаща среда, имат по-високи нива на cIAP2 иРНК и също така по-ниска чувствителност към TNF-α-индуцирана апоптоза. 14, 15, 17 Следователно, експресията на cIAP2 в SC и OM мастна тъкан може да отразява специфичната за депо чувствителност към апоптоза и по този начин да причини загуба или отлагане на мастна тъкан.

В това проучване не можахме да открием никаква разлика в степента на базална апоптоза между адипоцитите от двете депа. Вероятно обяснение е, че базалните апоптотични индекси са били твърде ниски, за да бъдат точно определени количествено и сравнени. Това мнение се подкрепя от факта, че Prins et al. 17 показва, че базалният апоптотичен индекс на мастните клетки, култивирани в серум-съдържаща среда, е много нисък, независимо от използвания метод. 6 Въпреки това не можем да изключим, че използваният метод е твърде нечувствителен, за да открие разлика в индексите на апоптоза между двете места на мастната тъкан, което би могло да корелира с разликата в експресията на cIAP2. В допълнение, физиологичната роля на специфичната за мястото разлика в експресията в cIAP2 в мастната тъкан все още не е проучена.

В обобщение, сравнихме експресията на cIAP2 иРНК в SC и OM мастна тъкан при 12 деца и 11 възрастни. По-висока относителна експресия в OM в сравнение с SC мастната тъкан е установена при деца и възрастни. Това предполага, че различното изразяване на cIAP2 между депата може да се дължи на присъщите свойства на клетките от двете депа. По-изразената депо-специфична разлика при децата може да отразява нетна печалба във висцералната мастна тъкан по време на растежа.

Денят на благодарността

Тази работа беше подкрепена от Фонда за научни изследвания на Комитета по образование на Дзянсу (99KJD 320012) и Шведския съвет за медицински изследвания (19X-05708). Благодарим на г-н Xu Xiaoqun, г-н Lou Yao, г-н Chen Yijiang и проф. Peter Naredi за предоставяне на проби от мастна тъкан за тези изследвания и професор Tommy Olsson за ползотворни дискусии.