Ефектът на синергията на хранителни вещества върху човешките остеосаркомни клетки U-2 OS; Д-р
М. Waheed Roomi, Вадим Иванов, Матиас Рат и Александра НидзвецкиАвтор-кореспондент: д-р Александра Нидзвецки.
1260 Memorex Drive
Санта Клара, Калифорния, 94050 САЩ
Телефон: 408-567-5564
Факс: 408-986-9403
Имейл: [email protected]
кратка версия
Въведение:
Текущата терапия за първични злокачествени тумори на костите или меките тъкани, които възникват от образуващи кости мезенхимни клетки, има лоша прогноза, особено поради повишения риск химиотерапията да развие други видове рак. Следователно са необходими нови стратегии за лечение, които са ефективни без токсични странични ефекти. Проучването in vitro, проведено наскоро в нашата лаборатория, показа, че Nutrient Synergy (NS), уникална формулировка, съставена от лизин, пролин, аргинин, аскорбинова киселина и епигалокатехин галат, има химиопрофилактичен ефект върху различни видове рак. NS демонстрира потенциална синергична противоракова активност чрез инхибиране на матрични металопротеинази, ключови ензими срещу инвазия и метастази.
Обективен:
Изследвахме ефекта на синергията на хранителни вещества върху човешките остеосаркомни клетки U-2 Os чрез измерване на цитотоксичността, коригиране на матрични металопротеинази (MMP): MMP-2 и MMP-9 и инвазивния потенциал.
Методи и вещества:
Човешките остеосаркомни клетки U-2 Os се култивират в среда McCloy, която се третира с 10% фетален говежди серум и с антибиотични 24-ямкови културални плаки. При сливането клетките бяха настроени на 0, 10, 50, 100, 500 и 1000 m g/ml хранителна синергия, всяка доза в три екземпляра. Цитотоксичността се оценява според броя на клетките, измерен чрез MTT теста след 24 часа, експресията на ММР чрез желатиназна зимография в контролната среда и инвазията от Matrigel.
Резултати:
Синергията на хранителни вещества е нетоксична при 10 mg/ml и настоящата реакция на дозата на токсичност от максимум 60% над контролното ниво от 1000 mg/ml. Зимографията показва дозозависимо инхибиране на продукцията на ММР-2 и ММР-9 чрез синергия на хранителни вещества с практически общо инхибиране при концентрация от 500 mg/ml. Инвазията на остеосаркомни клетки от Matrigel беше значително намалена при 50 mg/ml (74%) и напълно инхибирана при концентрация от 100 mg/ml.
Заключение:
Нашите резултати показват, че синергията на хранителни вещества е отличен кандидат за терапевтично приложение при лечението на остеосарком поради инхибирането на експресията на ММР, аглогенезата и инвазията - всички важни и обещаващи параметри за скрининг на рак.
Въведение
Остеосаркомът, първичен злокачествен тумор на костите или меките тъкани, който възниква от мезенхимните клетки, образуващи костите, обикновено се развива в дисталната част на бедрената кост (бедрената кост), проксималната (към ствола) пищяла (пищялната кост), проксималната раменна кост (раменната кост) и дисталния радиус (говори). Класическият остеосарком показва агресивен бърз растеж с висок риск от локални вторични метастази и ранни белодробни метастази. Това е най-често срещаният рак на костите и шестият най-често срещан рак при деца, който обикновено се развива при юноши, които изпитват скок на растежа. По-често се среща при момчетата, отколкото при момичетата. Повечето остеосаркоми възникват от ненаследени дефекти в ДНК на растящите костни клетки. Тъй като тези грешки се появяват произволно и непредсказуемо по време на растежа на костите, понастоящем не е възможно ефективно да се предотврати този вид рак (1).
Текущите терапии за остеосарком се състоят от хирургическа намеса (ампутация или спасяване на крайници) и химиотерапия. Тези терапии са свързани с лоша прогноза, особено поради силно инвазивния характер на този рак и повишения риск от метастази и развитието на други видове рак от химиотерапия. От 31 пробни пациенти с диагноза локализиран остеосарком (2) и лекувани с конвенционална химиотерапия (спасяване с високи дози метотрексат и левковарин при 3 пациенти и интраартериален цисплатин при 28 пациенти) в Центъра за рак на Андерсън, само 3 пациенти не са имали локален рецидив или Белодробни метастази през следващия период от 225+ месеца. Страничните ефекти на химиотерапията включват също анемия, необичайно кървене, повишен риск от инфекция поради разрушаване на костния мозък, чернодробно и бъбречно увреждане, менструални нарушения, цистит и кръв в урината, остеосарком на кожата и остеосарком, който метастазира в белите дробове, мозъка или други кости (1).
Един от ключовите механизми, чрез който раковите клетки се разпространяват и метастазират в тялото, включва и ензимно разрушаване на съединителната тъкан. Терапевтичните опити за ограничаване на този процес с конкретни лекарства не са успешни и понастоящем не са налични други средства за ограничаване на метастазите на рака. В продължение на десетилетия стандартната терапия за остеосарком се състои от хирургия и химиотерапия, които са насочени към унищожаване на раковите клетки, но не към метастази. Облъчването и химиотерапията са не само неефективни за постигане на излекуване, но атакуват всички клетки безразборно, причинявайки увреждане на клетките, унищожавайки съединителната тъкан и по този начин позволявайки метастази на рака. Очевидно е, че има нужда от безопасна и ефективна естествена процедура, която може да ограничи процеса на метастази на рак.
Всички видове ракови клетки образуват тумори чрез отслабване на извънклетъчния матрикс (ECM) с помощта на различни матрични металопротеинази (MMP). Активността на тези ензими върви ръка за ръка с агресивността на растежа на тумора и натрапчивостта на рака. През 1992 г. Rath и Pauling (3) установяват, че хранителните вещества като лизини и аскорбинова киселина могат да действат като естествени инхибитори на ECM протоанализа и че те имат потенциала да повлияят на растежа и разширяването на туморите. Тези хранителни вещества могат да упражняват своите противотуморни ефекти чрез различни механизми. Те включват инхибиране на MMP и укрепване на съединителната тъкан, която заобикаля раковите клетки (ефект на капсулиране на тумора). В предишно проучване демонстрирахме този антипролиферативен и антиинвазивен потенциал на лизин, аскорбинова киселина, пролин и епигалокатехин галат (ECGC) върху рак на гърдата при човека (MDA-MB 231), ракови клетки на дебелото черво (дебелото черво) (HCT 115) и меланомните клетъчни типове ( A2058) (4). Синергията на хранителни вещества също потиска растежа на тези тумори без неблагоприятни ефекти при голи мишки. В настоящото проучване изследвахме антитуморния потенциал на синергията на хранителни вещества in vitro върху човешки остеосаркомни клетъчни типове U-2 OS.
Поставяне на цели
Изследвахме ефекта на хранителната синергия (NS) върху човешките остеосаркомни клетки U-2 OS чрез измерване на цитотоксичността и регулирането на матрични металопротеинази (MMPs), MMP-2 и MMP9, както и инвазивния потенциал.
Методи и вещества
Клетъчни култури
Човешки остеосарком U-2 OS клетки са получени от ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD) и отгледани в среда на McCoy, допълнена с 10% фетален говежди серум, пеницилин (100 U/ml) и стрептомицин (100 mg/ml ) в 24-ямкови културни плочи (Costar, Cambridge, MA). Клетките се инкубират с 1 ml от средата при 37 ° С в инкубатор за тъканни култури (инкубатор) с 95% въздух и 5% CO 2, оставайки същите. При сливането клетките бяха третирани с хранителна синергия, разтворени в средата и тествани при 0, 10, 100 и 1000 mM, всяка доза в три екземпляра. След това плочите бяха поставени обратно в инкубатора. Цитотоксичността на реагентите се проверява след последващата 24-часова инкубация.
MTT тест
Жизнеспособността/цитотоксичността се оценява след клетъчна пролиферация чрез MTT тест както в безсерумна среда, така и в среда, допълнена с 10% PBS. Безсерумната среда от клетките беше отстранена и тествана за MMP. Клетките в ямките се промиват със смесен с фосфат физиологичен разтвор (PBS) и към всяка ямка се добавят 500 ml MTT (Sigma # M-2128) 5 mg/ml в PBS. Културите с култура се инкубират при 37 ° С за допълнителни 2 часа. Средата се аспирира внимателно и към всяка се добавя 1 ml DMSO (диметилсулфоксид), за да се разтворят образувалите се сини кристали формазан. Оптичната плътност беше измерена при 590n. OD 550 на разтвора DMSO във всяка ямка се гледа директно със спектрофотометъра BioSpec 1501, Shimadzu. OD 590 на разтвора DMSO във всяка ямка се счита за пропорционален на броя на клетките. OD 590 на контролата (лечение без добавяне) се счита за 100%.
Желатиназна зимография
Експресията на MMP в средата по подразбиране се определя чрез желатиназна зимография. Желатиназната зимография се визуализира в 10% полиакриламиден гел (Bio-Rad, Hercules, СА) в присъствието на 0,1% гел. Културната среда (20 ml) се зарежда и SDS-PAGE се показва с Tris-глицинов буфер. След електрофорезата геловете се промиват с 5% Triton X-100 в продължение на 30 минути. След измиване, геловете се инкубират в продължение на 24 часа при 37 ° С, в присъствието на 50 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, 5 mM ZnCl2, рН 7,5 и в продължение на 30 минути с Coomessie blue R 0,5 % зацапани и зацапани отново. Непрекъснато се следват протеиновите стандарти и се определя приблизителното молекулно тегло.
Matrigel Invasion Studies
Проучванията за инвазията бяха проведени чрез прилагане на вложки Matrigel (Becton Dickinson) върху плочите с 24 ямки. Клетките на остеосаркома, суспендирани в хранителен хранителен разтвор, както е посочено в плана на експеримента, бяха поставени във вложката на ямките. Както средата на вложката, така и в купичките получиха едни и същи добавки. След това плаките с вложките се инкубират в културен инкубатор, балансиран с 95% въздух и 5% СО2 за 24 часа. След инкубацията средата беше отстранена от кладенците. Клетките на горната повърхност на подложките бяха внимателно изстъргани с памучни тампони. Клетките, които са проникнали през мембраната на Mitragel и са мигрирали към долната повърхност на матригела, са оцветени с хематоксилин и еозин и оптично преброени под микроскоп.
Таблица 1 - Състав на синергията на хранителни вещества
Основен разтвор на синергични хранителни вещества, съставен съгласно пропорциите, показани по-долу, се разтваря в среда, както е посочено в плана на експеримента за третиране на клетките.
Статистически анализ
Резултатите са дадени като средни стойности + SE за групи. Данните бяха анализирани чрез независим "Т" тест.