Ефект на чай катехин епигалокатехин галат върху енергийния метаболизъм на мишката - PDF безплатно
Германски институт за хранителни изследвания (DIfE) Потсдам - Ребрюке, Катедра по фармакология Работна група Физиология на енергийния метаболизъм Ефект на тикатехин епигалокатехин галат върху енергийния метаболизъм на мишката Дисертация за получаване на докторска степен (д-р рен. Нар.) В Математическия и естествен факултет на Университета в Потсдам .-Хранителна наука Родена Майка Фридрих 1 ноември 1978 г., Магдебург Потсдам, февруари 2010 г.
Това произведение е лицензирано съгласно лицензионно споразумение на Creative Commons: Признание Без търговска употреба Без адаптация 3.0 Германия За да видите условията на лиценза, моля, следвайте хипервръзката: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/Публикувано онлайн на сървъра за публикации на Университета в Потсдам: URL http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2010/4815/ URN urn: nbn: de: kobv: 517-opus-48159 http: // nbn-Resolution .org/urn: nbn: de: kobv: 517-opus-48159
mrna MRP NaOH NEFA NMR pa PAS PC PCR PDB PDE PDHx PEPCK PIG-B PK messenger рибонуклеинова киселина мултирезистентност протеин каустик сода неестерирани мастни киселини неестерифицирани мастни киселини Ядрено-магнитен резонанс postabsorptiv Periodic acid Schiff stain Peid-Per-Per-Per-Per-Per-Per-Per-Per-F Пируват дехидрогеназен комплекс Фосфоенолпируват карбоксилаза Фенол-изоамилов алкохол-гуанидиний изотиоцианат-меркаптоетанол Пируват-киназа PLA 2 Фосфолипаза A 2 Плин Перилипин PO Палмитат окисление pp постпрандиал Пероксиден реактив-време реактивна реакция на реактивна реакция на реактивно време на реактивна реакция на кислород-реактивна реакция на реактивна реакция време на реактивна реакция на кислород-реактивна реакция Карбоксилаза SD Стандартна диета SGLT1 Натриев зависим глюкозен транспортер 1 SO субстрат окисляване StK Метаболитна клетка TG Триглицерид TM сухо вещество UCP отделяне на протеин VO 2 Консумация на кислород WAT бяла мастна тъкан СЗО Световна здравна организация VII
Въведение Полифенолите са флавоноидите, които от своя страна се разделят на флаваноли и катехини. Катехините в зеления чай съставляват до 30% от сухото вещество. Те се диференцират, както следва: (Фиг. 1-2): епикатехин (EC), епикатехин галат (ЕКГ), епигалокатехин (EGC) и епигалокатехин галат (EGCG). Структурните разлики възникват в броя на хидроксилните групи и в присъствието на галоилната група. С дял до 50% от общото съдържание на катехин, EGCG е преобладаващият катехин в зеления чай. В допълнение към катехините, зеленият чай съдържа протеини (15%), фибри (26%), други въглехидрати (7%), липиди (7%), минерали (5%), аминокиселини (4%) и пигменти (2%) (Cabrera и др., 2006). Фиг. 1-2: Химическа структура на основните компоненти на зеления чай (Koo & Noh, 2007) Друг компонент на зеления чай е кофеинът, който съставлява приблизително 3 6% (Yang & Landau, 2000). Чаша зелен чай съдържа между 20 и 100 mg EGCG и 20 40 mg кофеин (Stangl et al., 2006; Khokhar & Magnusdottir, 2002). Различните чайни катехини имат различна биологична активност, като EGCG показва най-висока активност (Chen et al., 1997). От чайните катехини той има най-голям брой хидроксилни групи в трите въглеродни пръстена, които са важни за образуването на водородни съединения. Галоиловата група, съдържаща се в молекулата EGCG, може да взаимодейства и с други молекули, напр. Б. Въведете радикали (Liao, 2001). 14-ти
Във въведението имаше особен интерес към изследването на полифенола EGCG, който се намира предимно в зеления чай. Много от ефектите, описани в литературата, са наблюдавани след продължителна употреба. Не е ясно дали промените в дългосрочните проучвания са причинени директно от EGCG или индиректно в резултат на намаляване на мазнините. Следователно за проведените тук разследвания беше избрана краткосрочна или средносрочна продължителност на заявлението, при което промените в телесния състав все още не бяха ясно изразени. Целта на тази работа е да се изследва подробно влиянието на чайния полифенол EGCG върху енергийния и субстратния метаболизъм след краткосрочно и средносрочно приложение. Мишката е избрана за модел на изследване, тъй като тя и хората са доста сходни по отношение на бионаличността на EGCG. Целта беше да се установи какво влияние има EGCG върху различни физиологични параметри в модела на мишката след кратко и средносрочно приложение. Метаболизмът на енергия и мазнини след краткосрочно и средносрочно приложение трябва да се изследва по отношение на енергийния баланс и на молекулярно ниво, за да се разкрият възможни механизми. 23.
Материал и методи Раздел 2-2: Хранителни източници на полусинтетичните диети с високо съдържание на мазнини Съставки [g/100 g] Експеримент 3 (вж. 2.2.3.3) Експеримент 4 (вж. 2.2.3.4) Казеин 1 20 18 Пшенично нишесте 2 40 43 Захароза 3 5 5 Палмово ядро 18 Ленено масло 5 1 Шафраново масло 6 1 Царевично масло 7 17 Целулоза 8 11 7 Минерална смес 9 5 5 Витаминна смес 10 2 2 Вода, мл 30 30 Енергийно съдържание [kj/g] 19,9 21,3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Постоянно млечно растение Peiting GmbH, Landshut (86% суров протеин) Kröner GmbH, Ibbenbüren/Westfahlen Nordzucker GmbH, Uelzen OTHÜNA, Ostthüringer Nahrungsmittelwerk Gera GmbH, Gera LARU Langensiep & Ruckebier GmbH, Bottrop Kunella Feinkost GmbH, Cottbus Mazoten Unilever Deutsch Mazola Unilever GmbH GmbH, Rosenberg Mineral-Trace Element Premix C1000 на 100 g: приблизително 930 mg; Р, 730 mg; Mg, 80 mg; Na, 440 mg; К, 710 mg; S, 170 mg; Cl, 360 mg; Fe, 20 mg; Mn, 10 mg; Zn, 3 mg; Cu, 800 mg; J, 40 mg; F, 400 mg; Se, 20 mg; Co, 10 mg (Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG, Lage) Витамин премикс C1000 на 100 g: A, 0,45 mg; Холекалциферол, 1,13 mg; К 3, 1 mg; Тиамин, 2 mg; Рибофлавин, 2 mg; В-6, 1,5 mg; В-12, 3 mg; Ниацин, 5 mg; Пантотенова киселина, 5 mg, фолиева киселина, 1 mg; Биотин, 20 mg; Холин хлорид, 100 mg; р-аминобензоена киселина, 10 mg; Инозитол, 10 mg; Е, 16,4 mg (Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG, Lage) 26
Материал и методи 2.2.3 Проектиране на теста За да се изследват ефектите на EGCG, бяха проведени няколко теста върху животни с различен дизайн. 2.2.3.1 Експеримент 1: Изследвания за краткосрочното и средносрочното влияние на EGCG върху параметрите на енергийния метаболизъм В този експеримент трябва да бъдат изследвани краткосрочните и средносрочните ефекти на приложението на EGCG върху параметрите на енергийния метаболизъм, особено енергийния метаболизъм. За тази цел бяха проведени два частични теста (фиг. 2-2). Фигура 2-2: Ход на проучванията върху животни, проведени за изследване на ефекта на EGCG върху параметрите на енергийния метаболизъм при мишки след кратко (1А) и средносрочно (1В) приложение ЯМР Определяне на телесния състав с помощта на ядрено-магнитен резонанс (ЯМР) спектроскопия (вж. 2.2.5) ITK непряка калориметрия на животните; Определяне на параметрите на енергийния оборот (вж. 2.2.6) Окисляване на SO субстрата посредством стабилни изотопи (вж. 2.2.7.1) StK t метаболитна клетка убиване 27
Материал и методи Фиг. 2-4: 13 C натрупване в избрани органи и тъкани, както и издишаният въздух при мишки след преминаване от стандартна диета (SD) към 13 C богата на мазнини диета (HFD); DOB = Delta над базовия EGCG тест Предварителният тест доведе до период на хранене от една седмица, за да се определи включването на 13 C в зависимост от приложението на EGCG. И тук мишките са преминали от SD към полусинтетичен HFD, който съдържа царевично масло като единствен източник на мазнини (фиг. 2-5). Основите са описани в точка 2.2.7.2. EGCG се прилага с фуража (групи: изходна група (SD), контрола, 0.25%, 0.50% EGCG (HFD), n = 8). Фигура 2-5: Тестова схема за изследване на 13-С включването на диетично маркирани триглицериди при мишки NMR определяне на телесния състав чрез NMR-спектроскопия (вж. 2.2.5) Проба от дихателни газове за определяне на 13-обогатяването чрез IRMS (вж. 2.2.7.1) убий 30
30 l/h комплект. За да се поддържа постоянна температура на околната среда (22 С), клетките за дишане бяха настанени в климатични шкафове (Vötsch Industrietechnik, Reiskirchen-Lindenstruth). Делът на консумацията на O 2 (VO 2) и производството на CO 2 (VCO 2) се определя за всяко животно в интервал от 6 минути. Според уравнението 2-2 (Frenz, 1999). Мишките получиха храната в 16:00, за да изследват влиянието на EGCG както при пост-абсорбционни, така и след прандиални условия. В краткосрочния експеримент храненето се комбинира с пероралното приложение на EGCG. 36
Материали и методи Плаката се пипетира, добавя се 150 µl от ензимния реагент (RGT), смесва се и се центрофугира. След време на инкубация от 10 минути при стайна температура, изчезването на пробите и стандарта се измерва спрямо заготовката на реагента (вода) при 500 nm (Power Wave 340, BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall). Концентрацията на холестерола в плазмените проби се изчислява, като се използва уравнението за линейна регресия от стандартната серия (уравнение 2-19). ymxn (ур. 2-19) yxmn наклон на концентрация на екстинкция на пресечната точка на права линия с оста y 2.5.1.2 Свободни мастни киселини Принцип Количественото определяне на свободните мастни киселини в плазмата се извършва с NEFA-C тест (Wako Chemicals GmbH, Neuss) . Принципът на реакция е показан в следващите уравнения (уравнения 2-20 до уравнения 2-22). R COOH Acyl CoA Synthetase ATP CoA SH Acyl CoA AMP PP i (Eq. 2-20) Acyl CoA O Acyl CoA Oxidase 2 2,3 trans Endol CoA H2O2 (Eq. 2-21) Peroxidase 2 H2 O2 4 Aminophena zone MEHA Quinone imine 4 H2O (ур. 2-22) R-COOH ATP CoA-SH AMP PP i мастни киселини аденозин трифосфат коензим А аденозин монофосфат фосфорна киселина 50
Материал и методи ΔE празен (E2 E1) празен 2 (E3 E2) празен (уравнение 2-29) ΔE проба (E2 E1) проба 2 (E3 E2) проба (ур. 2-30) Измервания на изчезване (E1-E3), определени за стойностите на пробата и празната стойност (ур. 2-29 до ур. 2-30). След това се изчислява разликата между стойността на пробата и празната стойност (уравнение 2-31). ΔE ΔE проба ΔE празна стойност (ур. 2-31) След това се изчислява концентрацията, като се използва дебелината на слоя съгласно следното уравнение (ур. 2-32): c β HB V MW β HB ε dv 1000 ΔE g/l (ур. 2 -32) V краен обем (ml) MW молекулно тегло -HB (104,1 g/mol) коефициент на екстинкция на формазан при 492 nm (19,9 l mol -1 cm -1) дебелина на слоя (1 cm) v обем на пробата (ml) Накрая изчислените концентрации на трикратните уредби бяха осреднени и беше взето предвид разреждането на плазмените проби 1: 2. 2.5.2 Определяне на триглицеридите в черния дроб За да се определи съдържанието на триглицериди в черния дроб, триглицеридите първо се екстрахират с НВ буфер. След това извлечените триглицериди могат да бъдат определени с помощта на комплект за определяне на триглицериди (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen). 55
Материал и методи TE буфер Tris-HCl EDTA в автоклав, т.е. 2 O регулиране на pH 8,0, автоклав 10 mm 1 mm 10xMOPS MOPS натриев ацетат EDTA pH 5,5 7,0; автоклав (промяна на цвета до жълто) 200 mm 50 mm 10 mm 1xMOPS - буфер за електрофореза 10xMOPS ad 1 l с автоклавиран dh 2 O 100 ml денатуриращ буфер 10xMOPS 100 µl 37% формалдехид 175 µl 50% формамид 500 µl ad 1 ml с автоклавиран dh 2 O работещ буфер глицерол 500 µl автоклавирана dh 2 O 400 µl 10xMOPS 100 µl върха на шпатула бромофенол синьо етидиев бромид разреждане 0,1% етидиев бромид 50 µl автоклавирана dh 2 O 950 µl 2.6.4 Пречистване на РНК с помощта на разлагане на DNase За да се сведе до минимум възможното замърсяване на РНК с геномна ДНК РНК екстракти, пречистени с комплект без ДНК на TURBO (Ambion/Applied Biosystems, Дармщат). За това приблизително 10 µl РНК (между 5-40 µg РНК) се смесва със 7 µl обработена с DEPC вода, 2 µl Turbo DNase буфер и 1 µl DNase за 30 минути при 37 ° С в термоциклер (Peltier Thermal Cycler PTC-200, MJ Research Inc., Waltham, MA, САЩ). След това към 65 се прибавят 2 ul реагент за инактивация на DNase
Материал и методи Таблица 2-12: количеството cdna от серията разреждания за определяне на концентрацията на ефективността на праймера 1 0,05 концентрация 2 0,20 концентрация 3 1 концентрация 4 5 концентрация 5 20 концентрация 6 50 cdna количество [ng] Графичното изображение на Логаритмизираните първоначални концентрации на разреждащата серия (ос x) спрямо стойностите на CT (ос y) водят до регресионна линия, чието увеличение се използва за изчисляване на ефективността (ур. 2-40, Vaerman et al., 2004). Ефективността обикновено е била 85-100%. E 10 1/m 1 (ур. 2-40) Относителното количествено определяне на генната експресия се извършва след нормализиране на референтен ген (тук: 18SrRNA, ур. 2-41). ΔC T C T („целеви ген) C T (18SrRNA) (ур. 2-41) Изчислената стойност на C T след това се изважда от фиктивната стойност 36 (ур. 2-42). Тук се приема, че при стойност на СТ от 36, няма амплификация на 18SrRNA, тъй като условията на реакцията (напр. Концентрации на праймери, концентрация на MgCl2) вече не са оптимални в края на PCR. ΔΔC 36 T ΔC T (уравнение 2-42) Експоненциалните стойности на C T бяха преобразувани в линейна форма чрез повишаване на степента на база 2 (уравнение 2-43). Относителна генна експресия 2 C T (ур. 2-43) 72