ДНК чип защо и за кого Swiss Medical Journal
обобщение
Структурните геномни аномалии играят определяща роля в патогенезата на заболяванията и често се срещат при пациенти с нарушения в развитието, синдроми на малформация, както и в туморната тъкан. Кариотипирането и флуоресцентната in situ хибридизация са стандартни инструменти за откриване на хромозомни пренареждания, но тези подходи имат ограничения. Анализът на ДНК микрочипове е методологична революция, която дава възможност да се изследва целият геном и да се идентифицират малки генетични пренареждания, които не са открити от конвенционалните техники. Целта на тази статия е да опише защо прилагането на тази нова методология в момента е от съществено значение при етиологичните изследвания на генетични заболявания, какви са границите на стандартните подходи и за анализ на ДНК микрочипове, който да се прилага в педиатричните клиники.
Исторически
Цитогенетичните анализи са част от етиологичната работа при пациенти със забавено развитие и/или умствена изостаналост, синдроми на малформа 1-3. От 70-те години на миналия век технологиите се усъвършенстват и се откриват структурни хромозомни аберации. Описани са нови синдроми, те се характеризират с постоянен клиничен фенотип, свързан с идентични геномни вариации, като например синдром на Прадер-Уили, свързан с делеция на хромозома 15, в 15ql 1.2-ql3 или синдром на Уилямс при делеция на хромозома 7, при 7ql 1,23. 4
Защо подход с микрочипове?
Важните ограничения на стандартните технологии са, че те зависят от: 1) разделителната способност на техниката на хромозомния анализ и 2) свързаната клинична информация. Кариотипът може да открие аномалии от порядъка на 4 до 5 мегабази (Mb) (праг на разделителна способност от 500 ленти на хаплоиден геном). Техниката на флуоресцентна хибридизация in situ (FISH) позволява по-нататъшно разделяне и открива пренареждане на няколкостотин хиляди бази (kb) (Фигура 1). Въпреки това, FISH може да се прилага само ако клиничната информация е внушаваща, предполагаща наличие на аномалии в един или повече специфични региони на генома. Всъщност е възможно да се определи наличието на генетична аномалия при пациент, като например пациент със синдром на Уилямс, ако анализът на FISH е насочен към интересуващия регион, а именно региона, ненормален в 7ql 1.23, свързан с това синдром.
Ето защо е необходим нов диагностичен подход. Неговата цел е била откриването на хромозомни дисбаланси с много малки размери в целия геном и това без да има специфично клинично извикване. Анализът на CGH на масива днес отговаря на това търсене, ражда се молекулният кариотип (Фигура 1). По този начин е възможно да се извърши общо геномно проучване, търсещо загуби или печалби от ДНК последователности. Разделителната способност, 100 до 1000 пъти по-голяма от тази на конвенционалния кариотип, дава възможност да се характеризират субмикроскопични структурни вариации, неоткрити от обичайните методологии, с разделителна способност от няколко хиляди бази (kb) (фигура 1).
Принцип
Технологията чрез "ДНК чипове" използва принципа на сравнителната геномна хибридизация (CGH) и се състои от кохибридизиране на същото количество ДНК от пациент и контролна контрола, всяка маркирана с флуорохром с различен цвят, върху масив от ДНК последователности (ДНК чип), представляващ целия геном. Флуоресцентните сигнали се отчитат с помощта на автоматизиран лазерен скенер. След това се извършва биоинформатичен анализ на данните с помощта на софтуер, който записва интензивността на различните флуоресценции. След нормализиране на тези данни се прави графичен отчет с помощта на софтуер, с коефициенти на хибридизация, близки до "0" за всички региони без структурна аномалия (Фигура 2). Значителното отклонение на тази стойност при няколко сигнала от една и съща геномна област предполага наличието на аномалии, загуба или печалба на ДНК. Този анализ се повтаря през целия геном. След това е възможно да видите кариотипа с лупа, съдържаща увеличение приблизително 1000 пъти (фигура 1).
Ограничение на подхода на ДНК микрочиповете
Не всички открити варианти са патогенни. Всъщност наскоро научихме, че два случайни генома се различават един от друг с няколко хиляди субмикроскопични структурни пренареждания. 5 Повечето от тези варианти нямат патологично въздействие. Следователно основното текущо ограничение е откриването на невалидирани геномни варианти. Трудността е да се направи разлика между вариант, който може да се счита за невреден, тъй като без патологични последици, и патогенен вариант. Само демонстрацията на връзка между геномните резултати, в този случай наличието на дефиниран вариант и описанието на подробна клиника ще позволи валидирането на клиничния характер на тези варианти в бъдеще. Вече са налични конкретни бази данни, DECIPHER (DabatasE на хромозомния дисбаланс и фенотип при хората, използващи Ensembl Resources) и ECARUCA (Регистър на небалансираните хромозомни аберации на Европейската асоциация на цитогенетиците), тяхната цел е да предоставят информацията, необходима за разбирането на наблюдаваните геномни вариации.
ДНК чипове: за кого?
Съгласно насоките на Американския колеж по медицинска генетика, анализът на микрочипове трябва да се прилага в комбинация със стандартния кариотип, особено за оценка на пациенти с умствена изостаналост и/или аутизъм и/или вродена аномалия. В педиатрията основните показания за различните цитогенетични анализи са обобщени в Таблица 1. 6 Тази технология може да се прилага и като допълнение към резултат от нормален кариотип и при наличие на множество малформации в областта на неонатологията и пренаталната диагностика.