Дискусия Стаж Marie Helene Guilleux Глутамат дехидрогеназа пречистване EC 1

Пречистване на глутамат дехидрогеназа ЕС 1.4.1.4 от семена от Pisum sativum - Marie-Hélène Guilleux - 2004

Дискусия - Заключение - Перспективи

1-ва част: пречистване

в. Суров екстракт и валежи от амониев сулфат

Първият етап на пречистване позволява да се получи фактор на пречистване, близък до 1. След утаяването с амониев сулфат се възстановяват 64% от общите протеини, следователно този етап допринася за елиминирането на протеините.

Само 59% от общата GDH амино активност се възстановява. Тази загуба на ензимна активност може да се обясни с инактивирането на GDH след третиране с амониев сулфат. Високата йонна сила, предизвикана от солта, може да причини денатурацията на ензима.

Дезаминиращата активност на GDH е 14181 nmol.min -1 в суровия екстракт и 8448 nmol.min -1 в пробата след утаяване с (NH4) 2SO4. Така че има толкова много аминираща дейност, колкото и дезаминираща активност. Няколко хипотези могат да обяснят тези резултати:

б. DEAE-целулозна анионообменна хроматография

Като нямаме данни за изследвания ензим, не знаехме дали ензимът ще се свърже или не с диетиламиноетилните групи (DEAE) на гела. 49% от общата аминираща активност на GDH се открива след елуиране с NaCl. Така че, 83% от аминиращата активност е намерена в сравнение с предишната стъпка.

Протеинът се прикрепи, което означава, че при pH 7,5, NADPH-GDH има отрицателен общ електрически заряд.

Този опит ни дава допълнителна информация. PKa на DEAE е 9,5, т.е.при pH 9,5 DEAE има общ нулев електрически заряд. При pH 7,5 (т.е. pKa-2), общият електрически заряд на DEAE е положителен.

За да се придържа, ензимът трябва да има отрицателен общ електрически заряд при pH 7,5. Така правим извода, че изоелектричната точка на ензима е около 5,5, тоест при рН 5,5 ензимът носи толкова положителни заряди, колкото отрицателните заряди.

Тези данни са важни, тъй като характеризират ензима. Стойността обаче трябва да бъде посочена за чист NADPH-GDH.

Този етап на пречистване позволява добив на обща аминираща активност на GDH от 49% и 43% от общите протеини се възстановяват. Факторът на пречистване се увеличава и достига 1,76, както и специфичната активност на GDH (6,7 nmol.min -1. Mg -1).

В допълнение, върху профила на елуиране се наблюдават два пика. Тези два пика са сходни както по отношение на общата активност, специфичната активност, пречистващия фактор, количеството на общия протеин и добива. Тези два пика могат да се обяснят със съществуването на няколко изоформи на GDH.

Що се отнася до дезаминиращата активност, тя се среща само в POOL 1 със скорост 704 nmol.min -1 .

Могат да бъдат направени различни интерпретации на резултатите от POOL 1:

Това може да е дезаминиращата активност на изоформата [EC 1.4.1.2]. В този случай този етап на пречистване би дал възможност за частично разделяне на изоформата [EC 1.4.1.4] от изоформата [EC 1.4.1.2], тъй като 44% от аминиращата активност се намира в POOL 1 срещу 8% от дезаминирането активност, в сравнение със стъпката на утаяване на амониев сулфат.
Това може да е дезаминиращата активност, която изоформата [EC 1.4.1.4] може да притежава не преференциално, което би представлявало 19% от аминиращата активност. В този случай в този пул ще присъства само GDH [EC 1.4.1.4].

Не е открита дезаминираща активност в POOL 2. Отново това може да се обясни с:

Това може да е изоформата [EC 1.4.1.4], която се елуира по-късно от първия пул. Това явление може да се дължи на обработката с амониев сулфат, която може да е променила третичната структура и следователно предполага разлика в поведението.
Възможно е изоформата [EC 1.4.1.3] да реагира по този начин при избраните условия (рН.).

За всеки от двата пула това може да бъде и смес от изоформи.

срещу. Пигментна афинитетна хроматография

Пигментният гел се състои от зелена смола, върху която лигандите са ковалентно свързани, които имат структура, подобна на тази на NAD (P). Ензимите, зависими от NAD (P) кофактори, ще могат да се свързват с него. Всъщност по-голямата част от общата активност на аминантен GDH се възстановява след елуиране с NaCl (33% в сравнение с предишния етап на пречистване).

Много от общия протеин се елиминира в резултат на тази стъпка (само 2,4% от общия протеин остава в сравнение с предишната стъпка), което прави възможно постигането на фактор на пречистване от 23,89. Специфичната активност също се увеличава и достига 90,8 nmol.min -1 .mg -1, което е доказателство за ефективността на пречистването.