Динамиката и агрегацията на катализираните протеини регулират белтъчните функции Max Planck Society
Биокатализа
Фиг. 1: Неактивната цистеин протеаза AvrRpt2 от Pseudomonas спринцовки се активира от пептидил-пролил-цис/транс-изомераза ROC1 от Arabidopsis thaliana. И двата протеина образуват комплекси на Michaelis, в които AvrRpt2 е субстрат за ROC1 и в които каталитичният процес води до увеличаване на скоростта на обратимата цис/транс изомеризация на критичната пролилова пептидна връзка.
Учените, работещи с Гунтер Фишер, са идентифицирали протеолитична реакция, при която трябва да е възможно да се сравни нарастването на верижната динамика на неактивна протеаза с активирането на протеазната функция в присъствието на пептидна връзка-цис/транс-Корелатна изомераза. Тази реакция действа като сигнален път за имунния отговор на растението към заразяването с бактерията Pseudomonas syringae известни. Неактивната цистеин протеаза AvrRpt2 се прехвърля в растение, кресова стена, чрез система за секреция от тип III на бактериите Arabidopsis thaliana, контрабандно. ROC1, прототипен пептидил-пролил-цис/транс-Изомераза в Арабидопсис, след това активира протеолитичната функция на AvrRpt2 по такъв начин, че някои резистентни протеини вече могат да станат ефективни (Фиг. 1).
Фиг. 2: Активирането на протеазната функция на неактивната цистеин протеаза AvrRpt2 от Pseudomonas syringae се постига с ROC1, прототипен циклофилин от Arabidopsis thaliana. Както показват HPLC профилите на реакционните смеси, фрагментът AvrRpt272-255 (1.0 µM) може да разруши Gly-Gly пептидната връзка във флуорогенния олигопептид Abz-IEAPAFGGWy-NH2 (y = 3-нитротирозин) дори по време на много дълга инкубация (255 часа) при стайна температура не се разделят (C). Само ROC1 (10 цМ) също е неактивен (В). Ако обаче и двата протеина се смесят с олигопептида в инкубационната партида, почти пълна консумация на субстрат може да се види само след няколко секунди (пик при 23,3 минути) (A). Двата продукта на разцепване Abz-IEAPAFG-OH (пик при време на задържане 17,2 минути; MW 822,9 g/mol; m/z 823,2) и и H-GWy-NH2 (пик при време на задържане 15,2 минути, MW 468,4 g/mol; m/z 469.1) е резултат от катализираната хидролиза на връзката Gly-Gly. Показан е и пикът CypA.
Тези изследвания доказват за първи път, че локалното увеличаване на динамиката на основната верига може да индуцира протеин да освободи предварително скрита способност, в този случай протеолизата на субстрата. В същото време става ясно, че този механизъм играе роля не само в епруветката, но и в живата клетка, напр. Б. при имунния отговор на растенията към бактериални инфекции. Понастоящем учените са в процес на идентифициране на пролина, отговорен за активирането на AvrRpt2 в неговата аминокиселинна последователност и получаване на изявления за структурата и динамиката на съответните комплекси Michaelis чрез NMR проучвания (служители: Cordelia Schiene-Fischer, Christian Lücke, Günther Jahreis).
Болест на Алцхаймер
Болестта на Алцхаймер е най-честата причина за деменция в Германия. Предполага се, че заболяването се основава на образуването на фиброзни протеинови отлагания - така наречените амилоидни фибрили. При болестта на Алцхаймер тези влакна са изградени от пептида Ар. Вероятно е обаче, че фибрилите не са решаващият стимулатор на заболяването, а по-скоро техните структурни предшественици, които се появяват като междинни етапи в процеса на формиране. Междувременно беше възможно да се изолират няколко от тези междинни етапи на сглобяване и да се изследват биохимично. В електронните микрографии се виждат както малки, сферични структури, така наречените олигомери, така и по-големи влакнести състояния, които са известни като протофибрили (Фиг. 3). В допълнение към морфологичната им форма обаче, по-прецизната молекулярна структура на тези междинни продукти остава скрита за дълго време. Заедно с работни групи в Магдебург, Лайпциг и Йена, Маркус Фендрих вече успя да получи подробна информация за структурата на тези олигомерни и протофибриларни междинни продукти.
Изображения с електронен микроскоп на амилоидни фибрили (вляво) и различни междинни съединения като протофибрили (в средата) и олигомери (вдясно). Лентата за мащабиране съответства на 200 nm.
Работата по структурата на протофибриларните и олигомерните междинни съединения стана възможна поради факта, че различни междинни етапи могат да бъдат стабилизирани за достатъчно дълго време, като се използват подходящи процеси и по този начин стават достъпни за биофизичните методи на изследване. В случая на протофибриларните междинни продукти това беше постигнато чрез по-ранна случайна находка. Работната група установи, че фрагмент от антитяло, който е изолирал, е в състояние да се намеси в конкретна стъпка в процеса на сглобяване и да предотврати превръщането на междинните продукти от протофибрилари в амилоидни фибрили. По този начин, Aβ протофибрилите могат да бъдат подложени на по-задълбочено структурно изследване, използвайки така наречената твърдотелна ядрено-магнитна резонансна спектроскопия. Този спектроскопски метод дава възможност да се наблюдават отделни атоми в молекулата и тяхната химическа среда.
Fändrich и неговият екип установиха кои структурни елементи стабилизират междинните етапи на сглобяването и как те се различават помежду си и от възрастните амилоидни фибрили в различни междинни етапи. Установено е, че междинните продукти - подобно на амилоидните фибрили - имат структура на β-лист, но това е подредено по различен начин в сравнение с по-късните етапи на сглобяване. Идентифицирането на стабилизиращите елементи в амилоидните междинни продукти е ключова предпоставка за развитието на таргетни инхибитори, които предотвратяват образуването на такива структури. Поради това в текущата работа групата разработва методи, базирани на пептиди, за да се намеси в механизма на образуване на невротоксични протеинови структури. Първите резултати са обещаващи и показват токсичен неутрализиращ ефект. В дългосрочен план се надяваме да можем да извлечем нови точки на атака или целеви структури за развитие на терапията.
PDI шаперони и клиентски протеини
ERp46 се различава от ERp29 по това, че може да изпълнява каталитична функция в окислително-възстановителните реакции. При различни концентрации на глюкоза се изразява по различен начин в β-клетките на островчетата Лангерханс в панкреатичната тъкан и може да служи и за контрол на адипонектиновите сигнали. Разликата в свойствата на свързване за ERp29 и ERp49 е очевидна в гореспоменатите пептидни библиотеки. От това се заключи, че ERp46 може да взаимодейства с ERp29 в две различни точки. За да се разберат по-добре тези взаимодействия молекулярно, третият домейн на ERp46 (домейн a´) беше кристализиран. В този контекст е интересно, че при мишки с дефицит на ERp29, ERp46 се регулира нагоре и в същото време се засягат и протеини, които контролират метаболизма на мастните киселини. За да проверят тези взаимоотношения, нокаутираните мишки ERp29 са подложени на диета с високо съдържание на мазнини и са анализирани за способността им да поемат глюкоза от кръвта (Фиг. 4г). Докато мишките от див тип показват значително намален профил на усвояване, което е характерно за непоносимостта към глюкоза при диабет, се установява значително подобрен профил за нокаутираните мишки ERp29 (P.