Диета с винилхлорид и високо съдържание на мазнини като модел на протокол за взаимодействие на околната среда и затлъстяването
Обобщение
Целта на този протокол беше да се разработи миши модел на токсично излагане с ниско ниво, който не причинява явно чернодробно увреждане, а по-скоро изостря съществуващите чернодробни увреждания. Тази парадигма по-добре рекапитулира излагането на човека и фините промени, които настъпват при излагане на токсични концентрации, за които се смята, че са безопасни.
Резюме
Винилхлоридът (VC), обилен замърсител на околната среда, причинява високи нива на стеатохепатит, но се счита за безопасен при по-ниски концентрации. Въпреки че няколко проучвания са изследвали ролята на VC като директен хепатотоксичен агент, концепцията, че VC повишава чувствителността на черния дроб към други фактори, като безалкохолен мастен черен дроб (NAFLD), причинен от диети с високо съдържание на мазнини (HFD), е нова. Този протокол описва парадигмата на експозиция за оценка на ефектите от хронична, ниска експозиция на VC. Мишките се ваксинират на диета с ниско съдържание на мазнини или с високо съдържание на мазнини в продължение на една седмица преди началото на инхалационната експозиция и остават на тази диета през целия експеримент. Мишките са VC (ниво под OSHA:
Въведение
Основният път на излагане на много токсини и замърсители в околната среда е чрез вдишване. След вдишване, съединението може да влезе в системната циркулация през белите дробове, да влезе в черния дроб и да се метаболитно активира от чернодробните ензими, преди да се екскретира 14, 15, 16. Често тези активни метаболити причиняват токсичност и увреждане на тялото. Предишни проучвания от тази група и други са използвали VC метаболити като заместители на експозицията на VC газ 17, 18. Други групи са използвали модели за инхалация на ВК; обаче са приложени изключително високи нива на експозиция (> 50 ppm), за да се предизвика остра токсичност, тежко чернодробно увреждане и развитие на тумор 19. Въпреки че тези проучвания предоставят важна информация и механизми на VC-индуцирана канцерогенност, те не рекапитулират фините ефекти и сложните взаимодействия с други фактори, допринасящи за това и следователно са по-малко подходящи за експозицията на човека.
Моделът VC за вдишване плюс високо съдържание на мазнини (HFD), описан тук (вижте фигура 1 за времевата линия) е първият модел на хронична експозиция на VC с ниски дози (т.е. концентрация под OSHA), при която мишките са изложени на токсина при условия, които много по-точно имитират експозицията на човека. Всъщност данните от този модел рекапитулират резултатите, наблюдавани при VC на хората, като ефектите върху метаболитните пътища 20, оксидативен стрес и митохондриална дисфункция 4. Други модели на вдишване на мишки, като напр Б. модели на главата и носа 21 изискват животното да бъде задържано, причинявайки стрес на животното. Тук този метод за излагане на цялото тяло не изисква инжектиране или ненужен стрес за животните. Животните имат свободен достъп до храна и вода и се поставят в по-голямата инхалационна камера за определен брой часове на ден и ден в седмицата. В допълнение, концепцията, че VC променя чувствителността към друг хепатотоксичен агент, е нова находка, открита за първи път от тази група 12 и оказва влияние върху експозицията на VC при концентрации, доста по-ниски от тези за директна хепатотоксичност задължителни са.
Този метод на инхалационно излагане може да се използва за имитиране на експозиция на голямо разнообразие от газообразни токсини, включително други летливи органични съединения, в нашата среда. Всъщност летливите органични съединения представляват голяма група замърсители на околната среда и са по-разпространени в индустриализираните райони, излагайки определени популации на по-висок риск от хронично излагане 22. Този протокол може да бъде адаптиран към различни експериментални въпроси. Продължителността и концентрацията на приложеното съединение могат да варират. Въпреки че първоначално е разработен за определяне на увреждане на черния дроб, други органи органи могат и са били изследвани с помощта на този модел 23. Изследователите, изучаващи хронична експозиция на животни, но желаещи да минимизират стреса при животните, трябва да обмислят този модел.
Протокол
Всички експерименти с животни/VC бяха одобрени от Министерството на здравето на околната среда, Асоциацията за безопасност за оценка и акредитация на лабораторни грижи за животните, а процедурите бяха одобрени от местния институционален комитет по грижа и употреба на животните.
1. Експериментална настройка и аклиматизация към пречистени, експериментални диети
ЗАБЕЛЕЖКА: Има няколко търговски системи за излагане на вдишване, вариращи от излагане само на носа до излагане на цялото тяло и ръчни до автоматизирани системи. Данните, публикувани преди това от тази група, са получени от холистична ръчна система 12, 23, 24. Фигура 2Фигура 3 показва диаграма, описваща автоматизираната система за излагане на вдишване.
4. Клетка за експозиция и подготовка на животни
- Извадете мишките от техните жилищни камери и ги поставете в отделните клетки на клетката за инхалационна камера (една опора за клетка за контролните мишки, друга за откритите мишки). Ежедневно рандомизирайте поставянето на всяка мишка в клетката, за да сте сигурни, че всяка мишка е хомогенно изложена в експозиционната камера. Отбележете броя и позицията на клетката на всяко животно в лабораторната тетрадка.
- Поставете всяка клетка в клетката в съответната камера и затворете вратите на камерата.
5. Провеждане на експозиция
- Завъртете крана на клапана за газовия резервоар VC в затворено положение и изключете всички въздушни потоци в експозиционната камера. Завъртете ротаметъра, докато няма въздушен поток през контролната камера.
- Отстранете вратите от всяка камера, за да проветрите мишките. Отстранете опорите на клетката от камерите. Извадете мишките с качулки от клетките за експозиция и ги поставете обратно в клетките им. Транспортирайте всички мишки обратно в жилищните им помещения за нощувка в редовни клетки.
- Изхвърлете всички отпадъци от контейнера за отпадъци в одобрен от Министерството на околната среда здраве и безопасност (DEHS) контейнер за биологична опасност, тъй като те могат да се считат за химически риск от институционалните здравни служби. Почистете вратите на камерата, тавата за отделяне, клетката за експозиция и камерата за експозиция за експерименталните и контролни системи.
7. Валидиране на концентрацията на VC в камерите по време на експозиция
8. Прекратяване на експеримента с излагане на вдишване
ЗАБЕЛЕЖКА: Според желаното време на експозиция, напр. Б. 6, 8 и/или 12 седмици след началото на експозицията при вдишване, експериментите приключват и животните се евтаназират (виж фигура 1 за времевата линия).
Представителни резултати
По време на експеримента телесното тегло на животните и консумацията на храна се наблюдават ежеседмично, за да се гарантира здравето на животните и да се направи оценка in vivo метаболизма. Фигура 3А. показва телесно тегло и консумация на храна за 12 седмичен експеримент. Теглото на тялото се измерва веднъж седмично и консумацията на храна два пъти седмично за всички групи. Всички мишки са натрупали тегло по време на проучването. Докато мишките в HFD групите натрупват повече тегло от мишките в LFD групите, както се очаква, изложените на VC мишки не наддават повече тегло от мишките в съответната контролна група. Консумацията на храна не се различава във всички групи 12, 24.
Фигура 3Б. Фигура 10 показва представителни фотомикроскопи на чернодробни секции, оцветени с H&E за анализ на общата морфология. В групата с LFD VC не причинява никакви необичайни патологични промени. HFD храненето значително увеличава стеатозата (натрупване на мазнини) и експозицията на ВК увеличава този ефект. В допълнение, излагането на VC доведе до някои възпалителни горещи точки в групата HFD 12, 24 .
Нивата на плазмените трансаминази (ALT и AST) бяха измерени като показатели за увреждане на черния дроб, а повишените нива на трансаминазите са показател за увреждане на черния дроб. В групата с LFD трансаминазата не се увеличава с VC. Само HFD леко повишава нивата на трансаминазите и преди всичко VC значително подобрява този ефект (Фигура 3° С.) 12, 24 .
Чернодробното тегло и съотношенията на телесното тегло са изчислени за всяка група. HFD значително увеличава съотношението на черния дроб към телесното тегло. VC обаче не увеличи значително този ефект (Фигура 3Д.) 12 .
Дискусия
Този модел на VC-усилен NAFLD е нов метод за оценка на ефекта от праговата експозиция на VC под OSHA при парадигма за вдишване на цялото тяло. Този модел позволява на изследователите да изследват субхепатотоксичните и сенсибилизиращи ефекти само от ниски нива на VC. Всъщност този модел на съвместна експозиция постига подобрено увреждане на черния дроб, повишаване на плазмените ALT и AST и умерено възпаление, като същевременно не засяга други органични системи, като сърцето, при тази концентрация. Този хроничен модел изисква камери за инхалация на цялото тяло, но минимизира нивата на стрес и експозиция. Въпреки че представеният тук протокол е софтуерен подход, нашият опит показа, че ръчният подход също е точен и последователен метод на експозиция 12, 24. В допълнение, той е лесно приложим за няколко изследователски области, включително други увреждания на органи 23, причинени от излагане на летливи органични съединения 22. По-специално, този модел може по-скоро да наподобява патогенезата на човешкото съвместно излагане на химикали от околната среда и основното заболяване 5 .
За да се постигнат подобни резултати, трябва да се постигнат определени критични стъпки в оптимизирането на протокола. Например оценителите трябва да определят, че концентрацията на VC или друг токсичен агент в камерите е в рамките на желания диапазон на експозиция (т.е. ниски, под-OSHA или остри нива). Оптимизирането на тази стъпка на инхалационната камера е от решаващо значение за успешния модел на излагане на човешки интерес. Второ, настройката на времето на експозиция на ден и продължителността на експеримента също могат да бъдат променени. В съответствие с интересите на тази група беше постигната настройка за професионална експозиция и беше изследван допълнителен параметър на хранене. С този протокол обаче могат да се моделират и експозициите на околната среда и острата експозиция.
Тази работа оспорва парадигмата, че настоящите граници на експозиция на VC (професионални и екологични) са безопасни. Въпреки че настоящата граница на експозиция на OSHA за VC е 1 ppm, този модел демонстрира, че концентрациите на VC под тази граница са достатъчни за облекчаване на чернодробните наранявания, причинени от HFD при мишки. Този протокол позволява на изследователите да изучават и характеризират нова парадигма на токсичното излагане и да моделират TASH.
Това е първият модел на хронична експозиция на VC с ниски дози. Предишна работа използваше много високи болусни концентрации, остра експозиция или активни метаболити като заместители на експозицията на VC. Всички тези подходи намаляват значимостта на констатациите за експозицията на човека. Следователно този нов модел на взаимодействие TASH-NAFLD предоставя необходимата платформа за изследователите да изучават сложни взаимодействия при ниска експозиция на ВК.
Този модел на токсично-индуцирано чернодробно увреждане може да се използва за други летливи органични съединения, а също и за изследване на други взаимодействия, които могат да засегнат черния дроб и други органи 8, 22, 23. В допълнение, този модел е бил и може да бъде използван по-нататък за изследване на интервенционни терапии и задълбочени механистични проучвания на начина на действие на този преобладаващ токсичен агент 24. Тъй като VC е известен канцероген 26, 27, 28, тази парадигма на експозиция може да бъде модифицирана и за изследване на VC-индуциран рак. Други съпътстващи заболявания, като алкохолно чернодробно заболяване, също могат да се влошат при съвместна експозиция на VC. Освен това би било интересно да се изследват различни видове мазнини като полиненаситени мастни киселини 18, 29, 30 или различни видове въглехидрати 31 и тяхното съвместно излагане на VC в този модел. Всъщност всички тези фактори имат различен ефект върху развитието на чернодробно увреждане и могат да играят роля при VC-индуцирано чернодробно заболяване.
В обобщение, това е нов инхалационен модел за токсични за околната среда увреждания на черния дроб и установява парадигма на експозиция за хронична, ниска VC експозиция. Концентрацията на VC, използвана в този модел, е субхепатотоксична сама по себе си, докато подобрява увреждането на черния дроб, причинено от друг фактор (HFD) при мишки. Този модел ще позволи на изследователите да изследват механизми и интервенции за хронична токсичност на VC и може да бъде полезен за транслационни проучвания, изследващи хора, изложени на хора, които са с най-висок риск от експозиция.
Разкриване
WT Goldsmith има финансов интерес към IEStechno, шаблона за описаната система. Останалите автори няма какво да разкрият.
Благодарности
Това проучване е финансирано с награди от Националните здравни институти (K01 DK096042 и R03 DK107912) на Джулиан Байер. Изследването е подкрепено и с награда за институционално развитие (IDeA) от Националния институт по общомедицински науки към Националните здравни институти с грант номер P20GM113226 и от Националния институт за злоупотреба с алкохол и алкохолизъм на Националните здравни институти с номер на награда P50AA024337. Съдържанието е единствена отговорност на авторите и не представлява непременно официалните възгледи на Националните здравни институти.