Човешки гликопротеини от животински клетъчни култури - спектър на науката
Човешки гликопротеини от животински клетъчни култури
Медицински опит
Структурата на Р-селектиновия лиганд е известна. Върху "гръбнака" на протеина, аминокиселинната верига, пет молекули захар (а именно фукоза, галактоза, N-ацетил-галактозамин, N-глюкозамин и невраминова киселина) са подредени в определена конфигурация върху аминокиселина. За да подобрим шансовете за успех на нашия проект, ние преследвахме две различни стратегии: В случай на in vitro път, извън живия организъм, захарната структура се изгражда върху пептид от специални ензими, гликозил трансферазите. Повечето от ензимите, необходими за това, не се предлагат в търговската мрежа. Те трябва да бъдат произведени биотехнологично. За тази цел генетичната информация за човешка гликозил трансфераза се въвежда в СНО клетка. Генът за гликозилтрансферазата е свързан със сигнална последователност, която кара клетката да секретира трансферазата. След това тези клетки се размножават и използват в клетъчни култури за производството на гликозил трансферази. В следващия етап ензимите, получени по този начин, се използват за изграждане на захарната структура на лиганда Р-селектин. И накрая, правилното разположение на захарните молекули може да се провери с помощта на масспектрометрия.
In vivo, в рамките на живата клетка, генетичната информация за различни човешки гликозилтрансферази и генетичната информация за протеина, който трябва да бъде гликозилиран, се въвеждат в една СНО клетка. Този път гените на гликозил трансферазите не са снабдени със сигнална последователност. Това локализира трансферазите в апарата на Голджи, клетъчна органела (която е отговорна за кондензацията и покриването на секретите). Генът на протеина се предшества от сигнална последователност. По този начин той е "предварително програмиран" за изхвърляне и на излизане от клетката преминава през апарата на Голджи. Гликозил трансферазите вече чакат тук, за да прехвърлят захарните молекули към протеина. Предимството на тази стратегия е, че клетката отделя биологично активен Р-селектинов лиганд. Трудността обаче е да се подредят тези различни гликозилтрансферази в правилното съотношение един към друг в апарата на Голджи.
Резултатите от изследването
Използвайки метода in vitro, успяхме да произведем биотехнологично пет различни гликозилтрансферази. С тези ензими синтезирахме захарна структура, която много прилича на целевата структура. Трябва да се добави само една молекула захар - и гликозил трансферазата, необходима за това, се предлага на пазара. Клетъчна линия, която експресира човешкия Р-селектинов лиганд в биологично активна форма, трябва да бъде произведена по in vivo път. След две години изследвания на генното инженерство, сега разполагаме с няколко клетъчни линии, които отговарят на това изискване. Производството на нашия целеви протеин в биореактори вече е започнало.
Благодарение на отличното сътрудничество между изследователски групи от пет европейски държави, беше възможно да се обединят биотехнологичните знания, разпространени в цяла Европа, и да се постигне целта на проекта. В допълнение към Института по биотехнологии към Forschungszentrum Jülich, Институтът по физиология към Университета в Цюрих, Стоматологичното училище към Университета в Копенхаген, Институтът за ензимни технологии към Университета в Дюселдорф, Катедрата по биоорганична химия в Университета в Утрехт и Институтът по гликобиология към Университета по гликобиокс към Университета на Оликофор . Заедно направихме първите успешни стъпки, за да предоставим протеин с висок терапевтичен интерес. Следните цифри показват колко голям е този интерес: От 350 генетично инженерни лекарства, които в момента се тестват клинично в САЩ, само десет са предназначени за лечение на септични симптоми.