Бактерициден ефект на вторичното растително вещество изотиоцианат - GRIN
Техническа работа (училище), 2012
36 страници, оценка: 1.0
Йоханес Рьослер (Автор)
Съдържание
2. Теоретични основи
2.1 Естествена поява на глюкозиди
2.2 Значение на изотиоцианата за растението
2.3 Химически принципи
2.3.1 Глюкозиди
2.3.2 Синигрин
2.3.3 Изотиоцианат
2.4 Ензимно преобразуване
2.5 Цел на семинарната работа
3. Експериментално изпълнение и обяснение
3.1 Използвани инструкции за изпитване
3.2 Екстракции
3.2.1 Екстракция на синигрин
3.2.2 Екстракция с мирозиназа
3.3 Ензимна хидролиза на глюкозидния екстракт до изотиоцианат
3.4 тънкослойна хроматография
3.4.1 Обяснение на метода на тънкослойна хроматография
3.4.2 Извършване на тънкослойна хроматография на Sinigrin
3.4.3 Извършване на тънкослойна хроматография върху изотиоцианат
3.4.4 Извършване на тънкослойна хроматография върху изотиоцианат и синигрин
3.5 ензимен тест
3.5.1 Извършване на ензимен тест
3.5.2 Извършване на тънкослойна хроматография на ензимния тест
3.5.3 Обяснение на ензимния тест
3.6 Антибактериални методи за откриване
3.6.1 Тест за инхибиране, за да се демонстрира антибактериалният ефект на изотиоцианат
3.6.2 Биоавтография
4. Резултати
4.1 Резултати от тънкослойна хроматография
4.1.1 Резултати от тънкослойна хроматография на Sinigrin
4.1.2 Резултати от тънкослойна хроматография на изотиоцианат
4.1.3 Резултати от тънкослойна хроматография на изотиоцианат и синигрин
4.1.4 Резултати от тънкослойна хроматография на ензимния тест
4.1.5 Rf стойности за представяне на относителното бягане в DC
4.2 Резултати от антибактериалните методи за откриване
4.2.1 Резултат от теста за инхибиране
4.2.2 Резултат от биоавтографията
7. Приложение
7.1 Списък на съкращенията
7.2 Таблици
1. Въведение
2. Теоретични основи
2.1 Естествена поява на глюкозиди
Глюкозидите се образуват от аминокиселини при вторичния метаболизъм на растенията (Watzl, 2001). Аминокиселините се разграждат до алдоксим, който се декарбоксилира до фенилоцетна киселина и след това до глюкозид (Kindl, 1975). Глюкозидите се срещат естествено само в растения от по-висок род (Dörnemann, 2008), напр. в семейство кръстоцветни (Brassicaceae, синоним. Cruciferae; Ahlheim, 1983) като най-важният представител на рода (Luciano, 2009). Глюкозиди обаче могат да бъдат намерени и в каперси (Capparidaceae), настурции (Tropaeolaceae) и растения Reseda (Rescedaceae) (Dörnemann, 2008). Понастоящем са известни общо около 130 различни глюкозиди (Wittstock, 2004). Съдържанието на сухо вещество в глюкозидите може да достигне до 1% при някои видове Brassica (Watzl, 2001), но количеството глюкозиди в дивата форма може да надвиши количеството, съдържащо се в култивираното растение, 1000 пъти (Watzl, 2001).
Глюкозидите от синапено масло се намират в горчични растения (Sinapis), които също принадлежат към семейство Кръстоцветни (Ahlheim, 1983; Dörnemann, 2008). Различните видове синап обаче образуват смес от различни глюкозиди от горчично масло (Lara-Lledó, 2012). Например, бялата горчица (Sinapis alba) произвежда предимно синапин, докато черната горчица (Brassica nigra) и ориенталската горчица (Brassica juncea) произвеждат предимно синигрин (Lara-Lledó, 2012). По принцип появата на остра миризма след унищожаването на клетъчната тъкан на растението може да показва наличието на глюкозиди от синапено масло (Dörnemann, 2008). Тази остра миризма се причинява от синапено масло (изотиоцианати), което се дължи на ензимното разграждане на синапеното масло глюкозид.
Ензимът, който хидролизира глюкозид от синапено масло, се нарича мирозиназа или β-тиоглюкозидаза (Lara-Lledó, 2012; Luciano, 2009; Watzl, 2001; Dörnemann, 2008). Среща се във всички растения, които произвеждат синапено масло.
2.2 Значение на изотиоцианата за растението
Продуктите от ензимното разграждане на глюкозидите от синапено масло осигуряват на растението високоефективни защитни вещества срещу хищници (тревопасни животни) и растителни патогенни микроорганизми (Wittstock, 2004; Aires, 2009). Тези продукти са различни изотиоцианати (ITC), тиоцианати и нитрили, които показват огромна токсичност срещу микробиологични организми (Lara-Lledó, 2012; Watzl, 2001; Wittstock, 2004; Luciano, 2009). Само изотиоцианатът има бактерициден, фунгициден, хербициден и токсичен ефект върху животинската тъкан (Aires, 2009; Luciano, 2009; Lara-Lledó, 2012; Hock, 1984).
Тази форма на самозащита на растенията е известна като конститутивна защита, тъй като предварителният етап на защитния агент се е образувал в клетката преди контакт с тревопасните или патогена. Растителният токсин обаче се произвежда само когато клетъчната структура е директно наранена. Този процес често се нарича „бомба“ от растително синапено масло, защото „се задейства“ само когато двата компонента влязат в пряк контакт (Wittstock, 2004).
В горчичното растение или синапеното семе горчичното масло глюкозид и мирозиназа са пространствено отделени един от друг. Ензимният субстрат (горчично масло глюкозид) се намира в отделения (вакуоли) близо до клетъчната стена (Rausch, 1999), докато ензимът (мирозиназа) се разпределя в така наречените индобласти (специализирани клетки/„чудаци“ от клетъчната структура) (Sitte, 1998) . Ензимът и неговият субстрат влизат в контакт чрез механично въздействие, след което реакцията започва и защитният токсин разгръща ефекта си (Dörnemann, 2008; Lara-Lledó, 2012; Watzl, 2001). Въпреки това, други растителни родове, които съдържат глюкозиди, съхраняват субстрата и ензима по различни начини. Кресът тал (Arabidopsis thaliana), например, образува така наречените глюкозид-съдържащи S клетки близо до ситото, както и собствени клетки на мирозиназа върху кората (Wittstock, 2004).
2.3 Химически принципи
2.3.1 Глюкозиди
Глюкозидите (глюкозинолати) (Фигура 1) са химически стабилни, нелетливи, йонни биомолекули, които принадлежат към групата на съдържащите сяра метаболити. Те се състоят от глюкозна единица върху сяра-азотсъдържаща група, сулфатна група и променлив остатък.Структурата по този начин е комбинация от тиоглюкозен остатък върху N-хидроксииминосулфатен естер и аглюконов остатък (R, виж по-долу). Този радикал може да се състои от алкилова, алкенилова, арилна или индолилова група. Той определя физиологичния ефект (Watzl, 2001; Wittstock, 2004). Съществува катион върху сулфатната група, обикновено K + (Dörnemann, 2008).
Фигура не е включена в този екстракт
Фигура 1: Обща структура на синапено масло глюкозид
Номенклатурата на глюкозидите е различна, така че когато се формира общото наименование, името на растението се предшества от „Глюкоза“ и се добавя окончанието „в“. Например, глюкозидът на кресон (Nasturtium officinale) е посочен като "Глюко-настурция" (Dörnemann, 2008). Систематичното име обаче е по-точно, както показва Фигура 2.
Фигура не е включена в този екстракт
Фигура 2: Пример за номенклатура кресон
2.3.2 Синигрин
Систематичното наименование на Sinigrin е алил глюкозинолат, химичното вещество е 1- (N- (сулфокси)-
3-бутенимидат-1-тио-β-D-глюкопираноза. Емпиричната формула е:
[C10H16NO9S2] -K +. Молекулното тегло е 397,46 g/mol (Sigma-Aldrich). Фигура 3 показва структурата на синигрин.
Фигура 3: Молекулярна структура на синигрин
Фигура не е включена в този екстракт
2.3.3 Изотиоцианат
Изотиоцианатите са обобщени под термина „синапено масло“. Изотиоцианатите са летливи и химически нестабилни молекули, ако са образувани от индоил глюкозинолати. Те спонтанно се разграждат до индол-3-карбинол и други индолови съединения (Watzl, 2001). Те възникват от ензимното разграждане на горчично масло глюкозид и имат токсичен ефект. Основната структура е както следва (Фигура 4):
Фигура не е включена в този екстракт
Фигура 4: Обща молекулярна структура на ITC
Когато алил глюкозинолатът се преобразува, се образува алил изотиоцианат (AITC) (Aires, 2009). Емпиричната формула за това е C4H5NS (структурна формула виж фигура 5). Молекулната маса е 99,15 g/mol (Sigma-Aldrich).
Фигура не е включена в този екстракт
Фигура 5: Молекулярна структура на AITC
2.4 Ензимно преобразуване
Хидролизата на горчично масло глюкозид в синапено масло се катализира от мирозиназа, при което сярно-глюкозната връзка на субстрата (горчично масло глюкозид) се хидролизира (Wittstock, 2004). Образуват се еквимоларни количества на β-D-глюкоза, сулфат и глюкозид-специфичния аглукон. Аскорбиновата киселина действа тук като коензим, тъй като може да осигури нуклеофилна каталитична група. Нестабилният аглукон реагира допълнително на първичния продукт, изотиоцианат, в зависимост от стойността на рН и температурата (Wittstock, 2004). Образуват се и вторични продукти като тиоцианати, нитрили и епитионитрили (Lara-Lledó, 2012). Изотиоцианатите се образуват главно при неутрална стойност на рН, докато нитрилите се образуват при кисела стойност на рН (Wittstock, 2004). Фигура 6 показва преглед на процеса на ензимно превръщане.
Фигура не е включена в този екстракт
Фигура 6: Механизъм и продукти на ензимното превръщане на глюкозиди
2.5 Цел на семинарната работа
Целта на тази работа е да се извлече синапеното масло глюкозид синигрин и ензимът мирозиназа от горчичните семена. Ензимът трябва да хидролизира глюкозида до изотиоцианат (ITC). Освен това антибактериалният ефект на ензимния реакционен продукт трябва да бъде потвърден и ITC трябва да бъде идентифициран в сместа от вещества на реакцията.
Целта на тази работа беше да се установи за първи път дали опростена версия на метода за биоавтография (Reusser, 1967) е подходяща за отделяне на изотиоцианата от реакционната смес в процеса на екстракция (тънкослойна хроматография) и идентифицирането му чрез токсичния му ефект върху бактериите.
Експериментите са проведени със семена от Brassica juncea, тъй като според информация от Develey GmbH те съдържат повече горчично масло глюкозид, отколкото семената на Sinapis alba, описани в инструкциите за експеримента (Dörnemann, 2008).
3. Експериментално изпълнение и обяснение
3.1 Използвани инструкции за изпитване
Инструкциите за изпитване за екстракция на мирозиназа и синигрин, протоколът за ензимно преобразуване и прилагане на тънкослойна хроматография (TLC), са в по-голямата си част инструкциите за курса: „Вторични растителни съставки“ от PD Dr. Dieter Dörnemann, Philipps University Marburg в департамента по биология (физиология на растенията/фотобиология), взето от (Dörnemann, 2008).
Въпреки това, отделните подпроцедури бяха променени независимо. Горчицата от сорта Brassica juncea се използва за извличане на синигрин и мирозиназа, тъй като този сорт има най-високо съдържание на синигрин и по този начин, според литературата, показва най-силен антибактериален ефект (Lara-Lledó, 2012).
Инструкциите за теста за бактериално инхибиране са взети от книгата „Mikrobiologisches Praktikum“ (Drews, 1983). Методологията на биоавтографията е модифицирана от: "Метод за биоавтография на тънкослойни хроматограми" (Reusser, 1967).
3.2 Екстракции
3.2.1 Екстракция на синигрин
Процесът за пречистване на синигрин започва с смилане на 10 g синапено семе в хаванче с добавяне на 30 ml 80% етанол (aq.). Това разрушава структурата на клетките и освобождава глюкозида. Алкохолът предотвратява ензимното превръщане на синигрина от мирозиназа. След това хомогенната маса се прехвърля в колба с едно гърло и се допълва до 100 ml с 80% етанол (aq.). След това продуктът се вари в продължение на 60 минути с помощта на обратен хладник (Фигура 7), нагряване на водна баня и температурата на кипене е около 85 ° C поради смес етанол/вода.
Фигура не е включена в този екстракт
Фигура 7: Екстракция на синигрин във Фигура 8: Колба на
Водна баня с обратен хладник 1. Екстракция на синигрин
В резултат на това синигринът беше свързан във фазата етанол-вода на сместа. След това полученият воден етанол супернатант се отстранява (1-ва екстракция, Фигура 8). Използвайки този метод, остатъкът отново се смесва с 50 ml 80% етанол (aq.) И този път той се вари само 30 минути с обратен хладник. Тази 2-ра екстракция трябва да увеличи добива на синигрин. Супернатантите от двете екстракции се комбинират и центрофугират, за да се отделят напълно твърдите вещества и супернатантата се изтегля отново за по-нататъшна обработка. В ротационен изпарител (Фигури 9 и 10) целият етанол след това се изтегля под вакуум и синигринът се концентрира във водната фаза (Фигура 11).
Фигура не е включена в този екстракт
Фигура 10: Преди да се концентрирате
Фигура не е включена в този екстракт
Фигура 9: Ротационен изпарител Фигура 11: След концентриране
Впоследствие сместа първо се допълва до 10 ml с H2O (dd), със силна бяло-жълтеникава утайка. След това се допълва до 30 ml с H2O (dd). След това се екстрахира няколко пъти с диетилов етер, в резултат на което хидрофобните компоненти (например клетъчни липиди) преминават в етерната фаза и се отстраняват от екстракта чрез повдигане и повторно използване на долната фаза. Гореспоменатата бяла утайка може да бъде отстранена чрез етерната екстракция. След това водната фаза, съдържаща синигрин, се концентрира до 5 ml в ротационен изпарител, за да се концентрира синигринът. Страничен ефект от изпарението е пълното отстраняване на останалия диетилов етер. Полученият препарат се разделя на 4 × 200 μl аликвотни части и се замразява при -20 ° С или се подлага на тънкослойна хроматография и ензимно превръщане.
3.2.2 Екстракция с мирозиназа
За да се инхибират клетъчните протеази, които могат да разградят ензима, който трябва да се екстрахира, мирозиназа, всички етапи на пречистване се провеждат по охладен начин, така че хоросанът, пестикът и приборите се охлаждат с N2 (течност) преди експеримента. Сега 20 g от синапеното семе (фигура 12) бяха смлени, освобождавайки ензима от клетките.
Фигура не е включена в този екстракт
Фигура 12: Зенкер Фигура 13: Декантиране Фигура 14: Диализна тръба
3.3 Ензимна хидролиза на глюкозидния екстракт до изотиоцианат
Заглавие Бактерициден ефект на вторичното растително вещество изотиоцианат (синапено масло) Степен 1.0 Автор Йоханес Рьослер (Автор) Година 2012 Страници 36 Каталожен номер V300661 ISBN (eBook) 9783656966845 ISBN (книга) 9783656966852 Размер на файла 1824 KB Език Немски Бележки 1-ва награда на 10-та студентска конференция на Техническия Университет в Мюнхен, сътрудничество с Helmholtz Center Мюнхен, подкрепено от Develey GmbH. Ключови думи Gymnasium Grafing, Технически университет Мюнхен, Helmholtz Zentrum München, студентска конференция на TUM, горчица, синапено масло глюкозид, изотиоцианат, биоавтография, мирозиназа, бактерициден ефект, Sinapis juncea, тънкослойна хроматография, тест за бактериално инхибиране, химия, биохимия, семинарна книга Цена (книга) € 14,99 Цена (книга) € 14,99 (електронна книга) 12,99 € работа, цитираща Йоханес Рьослер (автор), 2012 г., бактерициден ефект на вторичното растително вещество изотиоцианат (синапено масло), Мюнхен, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/300661
- Без коментари все още.