Бактериален цвят, грам-положителни и грам-отрицателни бактерии
Микроорганизмите в тяхното естествено състояние не се виждат не само в оптичните, но и в електронните микроскопи. Причината за това явление е тяхната прозрачност - тъканите на микроорганизма имат индекс на пречупване на светлината, подобен на стъклото.
Различни методи за оцветяване се използват за изследване на прокариоти под микроскоп, което прави възможно придаването на цвят на бактериите или части от тях. В допълнение, микробите имат тинкториални свойства - важна характеристика, състояща се в неравномерното взаимодействие на различни прокариотни тъкани с багрилото.
Оцветяващи бактерии
Има много начини да придадете цвят на микроорганизмите.
В зависимост от предмета на оцветяване, използваните за това техники се разделят на:
- положителни методи за оцветяване на тъкани на микроорганизми;
- отрицателни методи - оцветяване на пространството около бактериите, в резултат на което то става видимо като силует на рисуван фон.
Положителното и отрицателното оцветяване се разделят в зависимост от състоянието на микроорганизма на:
- жизнено (интравитално) оцветяване - най-често се използват слаби разтвори на метиленово синьо, конго червено и толуоидиново синьо;
- поствитално (фиксирано) оцветяване.
Оцветяването на фиксирани проби е най-ефективният начин за оцветяване на бактериите. В зависимост от желания резултат се използват прости или сложни методи за оцветяване.
Обикновено оцветяване
И така, простите методи за оцветяване на бактериите след витала позволяват да се получи информация за размера и формата на микроорганизма, да се установи локализацията и относителното положение на отделните прокариоти.
За оцветяване на бактериите обикновено се използват разтвори на алкално метиленово синьо или фуксин на Pfeifer. Методологично методът е прост: разтвор на багрило се нанася върху фиксиран препарат и се съхранява, съгласно метода, от 1 до 5 минути, след което цветната проба се измива (с вода) и се изсушава. Препаратът е готов и може да се извърши микроскопско изследване.
Комбинирани (сложни) методи на оцветяване
При по-дълбоки изследвания се използват сложни методи за оцветяване на фиксирани проби. Сложните методи за придаване на цвят на микроорганизмите предполагат ефекта на няколко оцветяващи реагента върху тестваното лекарство, единият от които се нарича основен, а останалите са допълнителни. Използват се и различни обезцветяващи агенти:
- киселини (сярна, солна в различни разреждания);
- алкохоли (най-вече етилов);
- ацетон и други.
Изисканите методи за оцветяване позволяват да се разкрие структурата на микроорганизма, други свойства и характеристики на бактериите.
Най-често срещаните методи за придаване на цвят на фиксирани препарати са следните:
- Метод на Грам;
- Техника Цил-Нелсън;
- Метод на Пешков;
- оцветяване по Романовски-Гиемза.
Грам петно
Методът за оцветяване на бактерии, предложен през 1884 г. от Г. Грам, се разпространява широко и е от голямо значение за систематиката на микроорганизмите и диагностиката на инфекциозни заболявания.
Методът на Грам се основава на биохимичните свойства на клетъчната стена на прокариотите; позволява ви да разделите всички микроорганизми на 2 групи:
- грам-положителни - в резултат на оцветяване те придобиват стабилен син цвят;
- грам-отрицателни - обезцветени при измиване, след като контрастират с червено багрило, те придобиват цвят от червен до розов.
Когато се оцветяват по Gram, се използват анилинови багрила - метил виолетово и тинтява - последвано от фиксиране на боята с йод. Оцветената проба се измива с алкохол, след което се получават 2 групи:
- микроорганизмите, оцветени в синьо, са грам-положителни;
- обезцветени бактерии - грам отрицателни.
Обезцветените грам-отрицателни микроорганизми се третират с червено багрило (сафранин или фуксин), което ги оцветява в червено-розовия цветен диапазон.
Установено е, че оцветяването разкрива наличието на външна мембрана при грам-отрицателни микроорганизми, която не позволява на багрилото да проникне в клетката.
Грам-положителните бактерии включват почти всички коки и спорообразуващи бацили, а грам-отрицателни бактерии - повечето от неспороносните микроби.
Оцветяване по Цил-Нелсен
Този метод на поствитално оцветяване, предложен от германските лекари Ф. Цил и Ф. Нелсън през 1883 г., дава възможност да се определят киселинно-устойчивите бактерии в пробата, по-специално причинителите на проказа, туберкулоза и микобактериоза.
Техниката на придаване на цвят на микробите се основава на присъствието на оксикиселини, липиди и восък в клетките на киселинно устойчиви прокариоти, което е причината за незадоволително оцветяване с разредени багрила.
При оцветяване по Ziehl-Nelson, фиксираният препарат се обработва с Ziehl карболов фуксин и се нагрява над горелката, докато се появят изпарения, охладят се и процесът се повтаря 3 пъти. След приключване препаратът се измива с вода, обезцветява се с разтвор на сярна или солна киселина и се измива старателно. След това лекарството се третира с разтвор на метиленово синьо в продължение на 1 минута, измива се с вода и се изсушава.
В резултат цветът на киселинно устойчивите микроорганизми е интензивно червен на фона на останалата част от микрофлората, която има светлосин цвят.