APTAMERS И ТЕХНИТЕ УПОТРЕБИ В БИОЛОГИЯТА И МЕДИЦИНАТА - Напредъкът в съвременната природознание (научен
Аптамерите са едноверижни ДНК или РНК молекули, които имат определена пространствена структура и поради това те са способни да разпознават други молекули или дори да проявяват каталитична активност. Имайте предвид, че такива пространствени структури могат да се образуват само от едноверижна ДНК или РНК, тъй като техните двойно верижни форми имат структура с двойна спирала, независимо от последователността. Името аптамер идва от латинското aptus - подходящ.
За да се получат аптамери с желаните свойства, технологията SELEX (систематично развитие на лиганди чрез експоненциално обогатяване - систематично развитие на лиганди чрез експоненциално обогатяване; [1, 2] Фланговете 'и 5' са с дължина 17-25 нуклеотида, а средните области Уникални са 20-60 нуклеотида. Такава библиотека може да бъде синтезирана като единичен препарат на олигонуклеотид, при който всеки от четирите нуклеотида е включен в средната част във всяка позиция с еднаква вероятност. Този препарат се инкубира с цел молекула, която обикновено е фиксирана върху някаква твърда подложка. Олигонуклеотидите, които не са свързани с мишената, се отстраняват и свързаните се усилват чрез PCR, използвайки общи 3 'и 5' флангове. Този цикъл се повтаря няколко пъти, което води до обогатяване с последователности, имащи афинитет към прицелната молекула.
И накрая, молекулите на аптамера се клонират в плазмиди и се тестват индивидуално за техните свойства. Тази технология дава възможност за получаване на аптамери за период от две седмици до няколко месеца. Опитът от използването на SELEX показа, че аптамери могат да бъдат получени за почти всяка цел: протеини, полизахариди, малки органични молекули, вируси и цели клетки.
Трябва да се отбележи, че олигонуклеотидните библиотеки, използвани в SELEX, не съдържат цялото възможно разнообразие от ДНК или РНК молекули. Обикновено такива библиотеки съдържат около 10–10–10–10 М олигонуклеотиди или 1014–1016 молекули, което съответства на броя на вариантите на олигонуклеотиди с дължина 25 (425 ≈ 1015). По този начин библиотеките със случаен регион, по-дълъг от 25, са силно недостатъчно представени. Това отваря възможността за допълнително подобряване на аптамерите чрез мутагенен SELEX. Тази процедура се различава от обичайната SELEX само по това, че във всеки цикъл на размножаване на аптамера се използва не конвенционален, а мутагенен PCR. По този начин е възможно да се "фина настройка" на аптамери, за да се увеличи техният афинитет или специфичност.
Аптамерите могат да се разглеждат като аналози на моноклонални антитела. Те обаче имат редица важни предимства пред антителата. Тяхното производство е много по-лесно, по-евтино и по-бързо от получаването на моноклонални антитела. Те имат много по-малък размер и следователно по-лесно проникват в тъканите и клетките, могат да имат по-висок афинитет и специфичност.
Аптамерите могат да се използват в следните изследователски, диагностични и терапевтични задачи:
1. За откриване на различни молекули - мишени, както в научни, така и в диагностични задачи. Те могат да заместят антитела при Western blotting, флуоресценция in situ хибридизация и ELISA.
2. Обещаващ формат за диагностика е създаването на чипове с много аптамери и възможността за едновременно откриване на много протеини.
3. За афинитетно пречистване на целевите молекули.
4. За ефективно и специфично инхибиране на целевите протеини. Това инхибиране може да се използва както за изследователски цели, така и за създаване на нови лекарства. Някои от тези лекарства вече са в клинични изпитвания.
Регулирани аптамери и аптазими
В допълнение към простото свързване с мишена, аптамерите могат да имат и по-сложни функции, например могат да имат регулирани или каталитични свойства.
За много изследователски задачи, както и при терапевтична употреба, може да бъде полезно да има аптамери, чието свързване с целта подлежи на регулиране. Такъв регулатор може да бъде допълнителна молекула, която се свързва с аптамера и променя афинитета си към целта. За да се получат такива аптамери, процедурата SELEX се модифицира, както следва. Ако допълнителна молекула трябва да наруши свързването на аптамера с целта, тогава във всеки цикъл свързването се извършва както при стандартна процедура и аптамерът се елуира чрез добавяне на ефекторна молекула. Ако допълнителна молекула е състояние на свързване, тогава свързването се извършва в присъствието на тази молекула и елуирането се извършва с буфер, който не го съдържа. Например при избора на аптамери за формамид пиримидин гликозилаза (ензим за възстановяване на ДНК), свързани аптамери се елуират с неомицин [3]. В резултат на това свързването на получените аптамери към целта спря в присъствието на неомицин.
Методът SELEX също така дава възможност да се получат аптамери с каталитична активност, която зависи от свързването към целта. Такива аптамери се наричат аптазими [4, 5]. Библиотеката на олигонуклеотидите, използвана за получаване на аптазим, първоначално съдържа част от характеризирания рибозим. Например, ударният рибозим е способен да разцепва собствената си последователност. В библиотеката има и произволна последователност. В хода на селекцията се избират онези молекули, които нямат каталитична активност при липса на мишена и придобиват такава активност в нейно присъствие. Някои от молекулите от тази библиотека ще се подложат на саморазцепване първоначално; следователно за цикъла SELEX са избрани само молекули в пълен размер. Те се инкубират в присъствието на мишената и разградените молекули се събират. За следващите цикли на SELEX към тези молекули е прикрепена постоянно разцепена част.