Апоптозата на кератиноцитите върви с инфилтрацията на cd8 лимфоцити и натрупването

субекти

абстрактно

Имунопатоморфологичното оцветяване на тъканни проби дава възможност за микроскопска оценка на морфологични детайли, фенотипове и наличие на маркери за активиране в инфилтриращите клетки. Наличието на лимфоцити, главно CD8 +, в близост до епителните клетки на кожата1 и наличието на едноклетъчна апоптоза са показателни за остър GVHD.23 Региони на ядрени организми (NORs) на базалните клетки са силно оцветени в кожни биопсии Острото натрупване на GVHD .4-NORs характеризира клетките в клетъчния цикъл.5 Той беше интерпретиран като знак за повишена скорост на пролиферация на кожни кератиноцити при остри GVHD лезии. NOR натрупването показва, че клетките са в клетъчния цикъл, но това може да не бъде завършено с успешна митоза. Ако клетъчното делене не може да бъде завършено, процесът завършва с апоптоза

В настоящата работа ние изследвахме връзката между степента на лимфоцитна инфилтрация и наличието на Ki67 + и апоптотични клетки в кожни биопсии, получени от пациенти с остър GVHD. В допълнение бяха оценени положителността на кератиноцитите към PCNA, циклин А и клетъчен цикъл 2 (cdc2). Този сложен анализ показва увреждане на цикъла на растеж на кератиноцитите при пациенти след BMT, което вероятно ще насърчи апоптотичните процеси, свързани с степента на локална инфилтрация на CD8 + клетки.

Пациенти и методи

Търпелив

Осемнадесет случая (10 възрастни и 8 деца) с хронична миелоидна левкемия (n = 6), остра левкемия и миелодиспластичен синдром (n = 7), апластична анемия и анемия на Fanconi (n = 5) са идентифицирани или с BM (12 пациенти) или с PBPC (5 пациенти). Един пациент (CML) е получил PBPC от майка си (алтернативна трансплантация на донор) (Таблица 1).

Режимът на кондициониране се състои от бусулфан (BU) 4 mg/kg телесно тегло и циклофосфамид (CY) 50 mg/kg телесно тегло, прилаган на 4 дни (обща доза 16 mg/kg телесно тегло и 200 mg/kg телесно тегло BU или CY) за осем пациенти с левкемия със стандартен риск или BU 4 mg/kg телесно тегло за 4 дни (обща доза 16 mg/kg телесно тегло) и CY 60 mg/kg за 2 дни (обща доза 120 mg/kg телесно тегло), допълнено с 5-15 mg/kg телесно тегло в 2 Дни (обща доза 10–30 mg/kg телесна маса) или 250 mg/m 2 тиотепа за 3 дни (обща доза 750 mg/m 2) при трима или двама пациенти с нисък риск. Случаите на FA получават 5–15 mg/kg телесно тегло антитимоцитен глобулин (ATG, Fresenius, Bad Homburg, Германия) в продължение на 5 последователни дни (обща доза 25–75 mg/kg телесно тегло) и CY 20 mg/kg телесно тегло, прилагани в 4 дни (обща доза 80 mg/kg телесно тегло). Пациентите със SAA получават CY в доза от 50 mg/kg телесно тегло за 4 дни (обща доза 200 mg/kg телесно тегло) и 5 mg/kg телесно тегло ATG за 5 дни (обща доза 25 mg/kg телесно тегло) (Таблица 1).

Острата GVHD профилактика включва циклоспорин А (CsA) за намаляване на серумните нива между 100 и 200 ng/ml и метотрексат (MTX) в доза 10 mg/m 2 или 5 mg/m 2 (само за пациенти със SAA) в дни + Достигнете 1, +3, +6 и +11. MTX е прекратен в два случая поради лигавична или чернодробна токсичност. Токсичността е оценена съгласно стандартните критерии на СЗО. Острите GVHD симптоми подтикват началото на лечението с преднизон от доза от 2 mg/kg телесно тегло, която се увеличава на интервали от 2 дни, ако не се появи реакция.

Биопсии на нормална кожа от четири случая (на възраст от 15 до 49 години), които са претърпели операция на гръдния кош за не-злокачествени и не-възпалителни заболявания, са използвани като контроли за проучвания на маркери на растежен цикъл. Маркирането на лимфни възли с метастатични лезии документира способността на антитела циклин А, cdc2 и Ki67 да откриват клетки в клетъчния цикъл (не е показано).

Методи

Кожни биопсии са взети при първите признаци на кожни лезии преди или на следващия ден (с изключение на един случай) след прилагане на преднизон (Таблица 1).

H + E оцветените секции бяха оценени съгласно публикуваните критерии за остри GVHD7 и апоптотични лезии.8 Инфилтрацията на мононуклеарни клетки беше оценена, както следва: по-малко от пет клетки в клъстер, степен 0; 6-20 клетки в клъстер, степен 1; 21 до 50 клетки в клъстер, степен 2; Фокусът съдържа повече от 50 клетки в клъстер, степен 3 и повече от един фокус в тъкан, степен 4.

Статистически анализ

За статистическа оценка на резултатите бяха използвани U-тест на Mann-Whitney U, точен тест на Fisher и тест на Student за сдвоени проби.

Резултати

Последователни биопсии на кожата (замразени секции) от пациент със стероид-резистентна остра GVHD (UPN 88). Броят на епителните клетки Ki67 + и апоптотичните клетки се увеличава, когато остър GVHD е напълно нараснал (+17 дни спрямо +31 дни след BMT) и отново намалява в крайния етап. Остра GVHD (+45 дни след BMT) (първоначално увеличение × 400) .

Остри GVHD степен III парафинови блокови секции, оцветяващи протеини, свързани с клетъчния цикъл и апоптотични клетки. Моля, обърнете внимание на натрупване на Ki67 антиген, PCNA и циклин А в разширени клетъчни ядра, липса на Cdc2-положителни клетки и редица апоптотични клетки в базовия слой на епитела (първоначално увеличение × 400).

Отчитат се Ki67 положителни клетки и се оценява степента на оцветяване. Фракцията на клетките Ki67 + в базалния слой на епидермиса е сходна и в двете проби със и без апоптотични клетки (средни стойности: 0,25 срещу 0,2). Обаче, оцветяването Ki67 + беше много по-силно в тъканни участъци с налични апоптотични клетки. Клетъчните ядра са по-големи и по-силно маркирани с Ki67 MoAb, отколкото биопсиите без апоптоза (Фигури 1 и 2). Това изображение е видяно в седем от девет проби с апоптотични клетки и само една от девет в тъканни участъци без апоптоза (P = 0,008) (Таблица 4).

Последователните биопсии на кожата показват, че както броят на клетките Ki67 +, така и апоптотичните клетки се увеличават с напредването на острата GVHD. Клетките Ki67 + при напреднал остър GVHD бяха групирани фокусно. В краен стадий на остър GVHD, както Ki67 +, така и апоптотичните клетки намаляват, тъй като броят на епидермалните клетки намалява (Фигура 1). PCNA оцветяването следва модела на Ki67, който е малко по-малък при биопсии с токсични лезии, за разлика от острата GVHD кожа (не е показано).

Пациентите са групирани според резултатите от оцветяването с TUNEL (Таблица 1). Група 1 се състоеше от пациенти с апоптотични клетки и група 2 от пациенти без апоптотични клетки в кожните им биопсии. Пациентите с апоптотични клетки в кожни биопсии са по-възрастни от пациентите без апоптотични клетки (средно ± sem: 24, 8 ± 3, 7 срещу 15, 2 ± 3, 4 години; P = 0,042) и по-често получават по-токсично кондициониране, към които етопозид или тиотепа принадлежат (4/9) срещу 1/9, NS) (Таблица 1). И двата фактора биха могли да допринесат за сериозни токсични усложнения на лигавицата, срещащи се по-често в група 1, отколкото в група 2 (P = 0,013) (Таблица 1). Всички пациенти с положително оцветяване на кожата за апоптотични клетки (група 1) са изпълнили хистопатологичните и клиничните критерии за остра GVHD. Дори в острия стадий на GVHD те са били по-напреднали от пациентите от група 2 (P = 0,015) (Таблица 1).

Шест остри GVHD, две кожни биопсии с токсични лезии и четири контролни кожни проби могат да бъдат изследвани за оцветяване на протеини, свързани с растежния цикъл в парафинови блокови секции. Във всичките осем проби (независимо дали са имали остри GVHD или токсични лезии) честотата на циклиновите А-положителни клетки е била по-висока от тази на cdc2-положителните клетки (32% срещу 8%; P = 0,072) (2 ) за разлика от нормалната кожа, която се характеризира със сходни пропорции на циклинови А- и cdc2-положителни клетки (3). Преобладаването на циклинови А-положителни спрямо cdc2-положителни клетки се наблюдава при биопсии с остра GVHD, независимо от резултатите от оцветяване с TUNEL. Въпреки това се наблюдава натрупване на циклин А във всичките четири биопсии с апоптотични клетки, но не и в нормална или болна кожа без апоптотични клетки (осем биопсии) (2 и 3). Моделът на оцветяване с циклин А е подобен на този на Ki67. Същото се наблюдава и при циклин А, когато се натрупва протеин Ki67 (2).

Нормални кожни парафинови блокови участъци оцветяват, както е описано на фигура 2. Трябва да се отбележи, че разпространението на PCNA в сравнение с клетките Ki67 + е положително, че циклиновите A- и Cdc2-положителни клетки присъстват в равни пропорции и че горният епителен слой е кафеникав (петна от апоптотични клетки) апоптозни ядра (оригинал Увеличаване × 400).

дискусия

Броят на апоптотичните клетки е нисък и те се наблюдават при пациенти с по-изразена лигавична и/или кожна токсичност. Те са свързани със тежестта на острата GVHD и степента на лимфоцитна инфилтрация в кожата, но не и с наличието на лимфоцити в епидермиса. Следователно апоптозата е част от картината на пълноценната остра GVHD, която включва увреждане на тъканите и инфилтрация на лимфоцити (Таблица 2).

Изглежда, че увреждането на кожата при пациенти след BMT е двустепенен процес. Генотоксичната обида първоначално засяга клетъчния цикъл и води до дефект на границата G 2/M. Въпреки относително високия дял на клетките, които са или Ki67- (Фигура 2), или AgNOR-положителни, това води до ниска митотична скорост на кератиноцитите.4 Тази ситуация прави клетките податливи на апоптотична смърт. Механизмът, чрез който крайното апоптотично попадение се доставя на кератиноцитите, не може да бъде изведен от настоящото проучване, но вероятно е свързан с инфилтрация на лимфоцити. По-скоро това може да се дължи на локално освобождаване на възпалителни цитокини, които могат да имат (напр. TNFα) потенциал за спиране на растежа22, но не и на директна ензимно-зависима атака на лимфоцити. Гранзимът предизвиква апоптотична смърт и изисква активност на cdc2 киназа 19, но изглежда липсва в кожата след BMT.