2D гел електрофореза - биология

The двуизмерна гел електрофореза или 2D гел електрофореза е аналитичен метод в биохимията, молекулярната биология и протеомиката. Той е разработен през 1975 г. от O'Farrell [1] и Klose [2] независимо. Той комбинира изоелектрично фокусиране (IEF) с SDS полиакриламиден гел електрофореза (SDS-PAGE) за разделяне на сложни протеинови смеси (бактериални лизати, лизати от висшите клетки или тъкани, телесни течности) в отделни протеини. Разделянето с особено висока резолюция се постига чрез комбинацията от двете техники за ортогонално разделяне.

Всяко петно в протеиновия модел съответства на тип (вид) протеинови молекули. Тъй като моделите на протеини в биологичните системи се променят в зависимост от околната среда и състоянието, те могат да се използват за разграничаване между увредени и здрави или оптимално и неоптимално отгледани клетки. Например те предоставят информация за причините за заболяването или механизма на действие на лекарствата на молекулярно ниво. Поради сложността на двуизмерните протеинови модели, за тяхната оценка се използват специално разработени компютърни програми.

приготвяне на пробата

Пробата се получава и обработва при възможно най-идентични условия. Това изключва, че в допълнение към експерименталните променливи, които трябва да бъдат изследвани, фалшифициращи влияния действат върху пробата. Протеините обикновено се утаяват от извънклетъчните местообитания (секретирани протеини). Вътреклетъчните протеини се извличат чрез внимателно разрушаване на клетъчните структури. Извън естествената си среда, протеините са особено податливи на образуването на агрегати и разграждането от протеази. Освен това подготовката на пробата работи близо до 0 ° C. Като правило се добавят урея и нейоногенни детергенти, както и инхибиращи протеазата вещества, за да се избегнат взаимодействия и промени в протеините.

Първо измерение (IEF)

По време на IEF (първо измерение), протеиновият екстракт се разделя едномерно в гел с градиент на рН в електрическо поле. Киселинните и основни аминокиселинни остатъци на протеините преминават през различни състояния (де) протониране в зависимост от околната стойност на pH и по този начин определят заряда на протеина. Следователно те са отговорни за ефекта на електрическото поле върху протеините. В изоелектричната точка (pI) положителните и отрицателните заряди на протеина се отменят взаимно. PI съответства на рН, при което протеинът има нетен заряд нула. Електрическото поле вече не действа като сила върху неутралния вече протеин и протеинът се отлага. Промените в местоположението в съседни диапазони на pH, причинени от дифузия, водят до подновено електрическо зареждане на протеина. Повторното ефективно електрическо поле обаче незабавно повишава белтъка обратно до изоелектричната му точка. Налични са две различни IEF технологии.

Имобилизирани градиенти на pH (IPG): Гел лентата се състои от полиакриламидна матрица. Единият край на гелната лента съдържа акриламидни производни с киселинни странични вериги в матрицата и тези с алкални функционални групи от другата страна. Съполимеризацията на неутралния акриламид с добавените в градиента киселинни и основни производни създава неизменен, неподвижен градиент на pH.
Градиенти на pH на базата на носещи амфолити: Носещите амфолити са синтетични аминокиселини и се движат свободно в гел лента или дълъг цилиндричен гел (обикновено в епруветка). Когато се прилага електрическо поле, те образуват градиент на рН, който обаче е нестабилен във времето. С увеличаване на времето носителите на заряд, определящи градиента, мигрират към краищата на гела и рано или късно деформират неговия ход.

Изравняване

При така нареченото уравновесяване, което следва разделянето след pI, гелът с протеините първоначално се редуцира (например с меркаптоетанол или дитиотреитол). Това служи за премахване на дисулфидни мостове. За да се предотврати повторно окисляване на получените -SH HS групи до дисулфидни (-S-S-) групи, HS групите са z. Б. алкилиран с йодоацетамид. И накрая, протеините се зареждат с натриев додецил сулфат (SDS). SDS е отрицателно зареден препарат. За всеки 3 аминокиселини, около една молекула на SDS се свързва с протеиновата молекула чрез нейния алифатен край чрез хидрофобно взаимодействие. С отрицателно заредената страна той се отблъсква от заредените краища в близост до свързани молекули на SDS. Това води до пълно разгръщане (линеаризация) на протеиновите молекули. Колкото по-голяма е протеинова молекула, толкова по-дълги са получените вериги, натоварени със SDS. Тъй като в зависимост от дължината на протеина се свързват голям брой отрицателно заредени SDS молекули, присъщият заряд може да бъде пренебрегнат за повечето протеини.

Второ измерение (SDS-PAGE)

Гелната лента с протеини, разделени и уравновесени според стойността на рН, се поставя на ръба на квадратния или правоъгълния полиакриламиден гел, съдържащ също SDS, и протеините сега се разделят според размера им, перпендикулярно на първото измерение във втора електрофореза. Когато се приложи електрическото поле (анод срещу IEF гел лентата), разгънатите протеини, заобиколени от SDS, мигрират с излишъка си от отрицателни заряди през гела, което предлага на протеините по-голяма или по-малка устойчивост според техния молекулен размер. Малките молекули мигрират относително необезпокоявани и бързо достигат до ръба на гела, обърнат встрани от IEF гела, докато големите молекули непрекъснато се забавят от гела, тъй като мигрират и едва ли правят напредък. Разделянето във второто измерение се спира, когато малките протеини пристигнат на ръба на гела, обърнат встрани от IEF гела. Това става видимо от придружаващо багрило, като бромофенолово синьо. За да може протеиновият модел да остане наличен след разделяне, той трябва да бъде фиксиран в последния етап. За това се използват метанол и оцетна киселина. Те денатурират отделените протеини и ги свързват с гел матрицата. Това предотвратява дифузията и 2D моделът е стабилен във времето.