Влияние на болестите на щитовидната жлеза върху процеса на клетъчно стареене, EUROLAB, Научни статии
Стареенето е многопричинен процес, причинен от много фактори, чието действие се повтаря и натрупва през целия живот. Стареенето води до функционална малоценност на клетки от различен тип. Освен това дълбоките възрастови промени в метаболизма, функциите и структурата завършват не само с функционална дефектност на клетките, но в крайна сметка водят до тяхната смърт. Въпреки това, дори функционално хомогенните клетки стареят с различна скорост. Сред един и същ клас клетки - нервни, мускулни, чернодробни, ендокринни и др. - е възможно да се разграничат клетки с груби нарушения на структурата и функцията, с изразени признаци на хиперфункция, комплекс от адаптивни реакции [1]. По този начин в много клетки се отбелязва намаляване на ядрено-цитоплазмения контраст; броя на митохондриите, тяхното подуване, нарушено възстановяване и репликация на ДНК, намаляване на броя на рибозомите. Основните механизми на стареене са свързани с генната дисрегулация. Неговите промени водят до промяна в съотношението на различни протеини, намаляване на потенциала на системите за синтезиране на протеини. С възрастта соматичните клетки натрупват не само мутации, но и хромозомни пренареждания. Смята се, че промените на хроматина могат да играят основна роля във възрастовите промени в генната регулация [2]. В процеса на стареене именно натрупването на генетични увреждания в клетката заема централно място, докато имунологичните, хормоналните и метаболитните увреждания се считат за спомагателни. Една от причините за натрупването на увреждане на ДНК с възрастта може да бъде намаляване на ефективността на системите за възстановяване на ДНК. Клетъчното стареене е придружено от различни хромозомни промени: аномалии в броя на хромозомите, вътрешногрупови вариации в броя на хромозомите, структурни промени в хромозомите, поява на маркерни хромозоми-аберации. Стареенето на клетките вероятно е свързано с появата на спонтанни хромозомни аберации. Хромозомната нестабилност по време на стареенето води до появата на голям брой клетки с различни количествени и структурни аномалии, които се появяват по време на хромозомни аберации [3]. Смята се, че промените в хроматина могат да играят основна роля в свързаните с възрастта промени в регулацията на генната експресия. С остаряването има нарушение на процесите на транскрипция и транслация. Молекулярните събития, които определят транскрипцията, са от решаващо значение при изучаването на механизмите на стареене, тъй като регулирането на генната експресия влияе основно на стареенето и старческите промени.
Цел на работата: изследване на структурни и функционални нарушения на хромозомите и хромозомни аберации, които се появяват в клетките на щитовидната жлеза (TG) по време на стареенето.
Материали и методи за изследване
Полирибозомите и ДНК бяха изолирани от клетките на щитовидната жлеза и кръвта на хора с различни форми на патология на щитовидната жлеза. Създадохме три възрастови групи хора без патология на щитовидната жлеза и с някои форми на патология на щитовидната жлеза:
- 1-ва група - 10 души на възраст 45–55;
- 2-ра група - 12 души на възраст 55–65 години;
- 3-та група - 8 души на възраст 65–75 години.
Контролна група - 12 души на възраст 25 години.
За да изолираме общите полирибозоми от клетките на щитовидната жлеза, използвахме магнезиевия метод за изолиране на полирибозоми [4], който помогна да се постигне оптималният им добив. Методът се основава на свойството на полирибозомите, открити от Takanami [5], да се утаяват от разтвор под действието на високи концентрации на магнезий. Общата РНК се изолира чрез SDS-фенол-хлороформ метод. Изолирането на ДНК с високо молекулно тегло от левкоцитите на човешката кръв се извършва чрез фенолна екстракция [6]. Култивирането на лимфоцити се извършва в хранителна среда, състояща се (на бутилка) от: 6 ml среда RPMI 1640 с глутамин (PANEKO, Русия), 1 ml фетален телешки серум (произведено във Франция - Германия), 40 μg/ml гентамицин и 20 µg/ml митоген - фитохемаглутинин (PHA DifcoP), бяха добавени 0.8 ml цяла кръв. Препаратите се оцветяват с 4% разтвор на Романовски - Гиемза. Анализът е извършен на етапа на метафазата. Ядрата от клетките на щитовидната жлеза се изолират чрез утаяване в 0,25 М захароза, съдържаща 5 mM MgCl2, 1 mM дитиотреитол (DTT), 10 mM Tris-HCI pH7,5 и ядрата се пречистват чрез наслояване върху разтвор на 2 М захароза в буфер В (24 000 об/мин 1 час, ротор SW 27). За да се определи чувствителността на DNase, ядрата са третирани с DNase 1 (2000 U/mg Serva), инкубирани при 4 ° C в продължение на 5 минути с различни концентрации на DNase I (от 0,1 до 100 U/ml) или с фиксирана концентрация на ензима (20 U/ml/ml) при 37 ° С за 15 минути. Изолирането на ДНК фракции от кръвни клетки се извършва по модифициран фенолен метод, който прави възможно изолирането на три ДНК фракции поради използването на различни условия на депротеинизация. Допълнителна ДНК за TG гена се синтезира чрез полимеразна верижна реакция (PCR) върху 0,5 μg обща РНК в присъствието на обратна транскриптаза, като се използват праймери, специфични за TG гена: 51-AGGCTAGGAAAATGGCCCTGGTCC-31 и 51-TTGGATCCTTAT 31GTGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG PCR се провежда в инкубационна среда: 50 μl съдържа 60 mM Tris-HC1 (рН 8,6), 6 mM EDTA, 10 mM β-меркаптоетанол, 10 μg/ml BCA, 1 mM всеки от 4 нуклеотида, 2 единици. обратна транскриптаза. PCR има общо 55 цикъла. Синтезът се провежда при 72 ° С в продължение на 4 минути. Следващите цикли включват денатурация (1 min, 49 ° C), отгряване на праймерите (1 min, 55 ° C) и синтез на cDNA (2 min, 72 ° C). След 55 цикъла на амплификация, пробите се държат в продължение на 10 минути при 72 ° С и след това се охлаждат, вземат се аликвотни части, извършва се електрофореза на cDNA за TG гена в 1% агароза с етидиев бромид.