Субакутни церебрални микрокръвоизливи, индуцирани от инжектиране на липополизахарид при протокол от плъхове

Обобщение

Представяме протокол за индуциране и откриване на MHCs, индуцирани чрез инжектиране на LPS при плъхове Sprague-Dawley, който може да се използва в бъдещи изследвания върху патогенезата на MHCs.

Резюме

Церебралните микрокръвоизливи (CMHs) са често срещани при пациенти в напреднала възраст и са свързани с различни невропсихиатрични разстройства. Етиологията на МНС е сложна и невро възпалението често се разглежда като съпътстваща поява. Тук ние описваме субакутен MHCs модел на плъхове, индуциран чрез инжектиране на липополизахарид (LPS), както и метод за откриване на системно инжектиране на LPS MHCs. е относително проста, икономична и рентабилна. Основно предимство на инжектирането на LPS е неговата стабилност да предизвика възпаление. MHCs, индуцирани чрез инжектиране на LPS, могат да бъдат открити чрез грубо наблюдение, оцветяване с хематоксилин и еозин (HE), оцветяване с пруски Perl, двойно оцветяване на Evans синьо (EB) и технология за образна чувствителност на магнитен резонанс (MRI-SWI). И накрая, в този доклад се обсъждат и други методи за разработване на CMH животински модели, включително техните предимства или недостатъци.

Въведение

Класически церебрални микрокръвоизливи (MHC) Вижте периваскуларни малки отлагания на продукти от разграждането на кръвта като хемосидерин от червените кръвни клетки в мозъка 1. Според проучването Rotterdam Scan CMH са открити при почти 17,8% от хората на възраст от 60 до 69 години и 38,3% при тези над 80 години. Разпространението на MHCs при възрастните хора е относително високо и е установена корелация между натрупването на MHCs и когнитивната и невропсихиатричната дисфункция 3, 4. Наскоро бяха съобщени няколко животински модела на MHC, включително модели на гризачи, индуцирани чрез инжектиране на стереотаксична колагеназа от тип 5, трансгенни APPs 6, експозиция на β-N-метиламино-L-аланин, 7 и 8 на хипертония, с MHCs, индуцирани от системно възпаление като един от най-признатите избори. Fisher et al. 9 за първи път се използва LPS, получен от Salmonella typhimurium, за разработване на остър модел на мишка MHC. Впоследствие същата група съобщава за развитието на подостър модел MHC мишка, използвайки същия подход 2 .

LPS се счита за възпалителен стимул, стандартизиран чрез интраперитонеална инжекция. Предишни проучвания потвърдиха, че инжектирането на LPS може да предизвика невровъзпаление, което се отразява от голямото количество микроглиални клетки и активирането на астроцитите при моделирани животни 2,10 Освен това е установена положителна връзка между активирането на активирането на невровъзпалителното активиране и броя на MHCs 2, 10. Въз основа на тези предишни проучвания бяхме поканени да разработим модел на MHC на плъхове чрез интраперитонеално инжектиране на LPS.

Напредъкът в технологиите за откриване доведе до увеличаване на броя на търсенията в MHC. Най-широко признатите методи за откриване на MHC включват откриване на червени кръвни клетки чрез оцветяване с хематоксилин и еозин (HE), откриване на железно желязо от пруско синьо оцветяване 9, откриване на сини отлагания на Evans чрез имунофлуоресцентно (EB) изобразяване и 7.0 тесла за магнитен резонанс -Претеглено изображение с възприемчивост (MRI-SWI) 10. Настоящото проучване има за цел да разработи метод за скрининг за МНС.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Всички методи, описани тук, са одобрени от PLA и Комитета за използване на животните (ACUC) на армейската болница.

1. материали

  1. Подготовка за инжектиране на LPS
    1. Добавете 25 ml дестилирана вода към 25 mg LPS прах, получен от Salmonella typhimurium, до крайна концентрация от 1 mg/ml. Съхранявайте инжекцията в стерилна епруветка при 4 ° C.
      ВНИМАНИЕ: LPS е токсичен.
    2. Пригответе 2% EB разтвор в 0,9% нормален физиологичен разтвор, за да поддържате инжектирането на EB в работна концентрация.

  1. Прилагайте LPS на 10-седмични мъжки плъхове Sprague-Dawley (SD) (средно тегло: 280 ± 20 g) чрез интраперитонеална инжекция.
    ВНИМАНИЕ: Ако плъховете са закупени от друга организация, фазата на адаптация не трябва да бъде по-малка от 7 дни.

3. LPS инжекции

  1. Инжектирайте LPS интраперитонеално всички плъхове в доза от 1 mg/kg и върнете плъховете в домашната им клетка.
    Забележка: Не е необходима анестезия.
  2. Шест часа по-късно инжектирайте същата инжекционна доза LPS в плъховете.
  3. Шестнадесет часа по-късно инжектирайте същата доза LPS в плъховете.
    ВНИМАНИЕ: Инжектирането на SD плъхове с LPS в доза от 1 mg/kg може да доведе до смъртност от 5%. Смъртността може да се увеличи допълнително при по-млади или по-възрастни плъхове или бременни плъхове.
  4. Върнете плъховете в клетките си след инжектиране на LPS и осигурете достъп до храна и напитки ad libitum .
    ЗАБЕЛЕЖКА: Плъховете ще проявяват отчетлив системен възпалителен отговор и поради това е от съществено значение клетките да останат чисти по време на експеримента. Плъховете трябва да се наблюдават често (2 пъти на ден) за тегло, общ вид и отношение след първата инжекция на LPS. Ако плъховете започнат да проявяват прегърбена стойка, нежелание да се движат, значителна загуба на тегло (> 20%), оцветяване с порфирин, те хуманно евтаназирани до проучване на крайната точка на EB ден 7.

4. пробата

5. има оцветяване

Забележка: Тази процедура се извършва с помощта на комплект за оцветяване на очите.

  1. Измийте предметните стъкла в дестилирана вода.
  2. Оцветете в разтвора на хематоксилин за 8 минути. измийте в течаща вода за 5 минути.
  3. Диференцирайте в 1% киселинен алкохол за 30 s. измийте в течаща вода за 1 мин.
  4. Препарат за отстраняване на петна при 0,2% амонячна вода (посиняване) или наситен разтвор на литиев карбонат за 30 s до 1 min. измийте в течаща вода за 5 минути.
  5. Изплакнете с 95% алкохол (10 потапяния).
  6. Контраст с разтвор на еозин за 30 s до 1 min.
  7. Дехидратира се чрез 95% алкохол, две промени на абсолютния алкохол, по 5 минути.
  8. Прозрачно в ксилол за 30 s.
  9. Изкачете се по метода на Liu 9 .
  10. Анализирайте с помощта на флуоресцентен микроскоп с ярко поле.
    ЗАБЕЛЕЖКА: червените кръвни клетки, освободени от кръвоносните съдове, които са съставни части на MHC, са показани в червено-оранжево оцветяване под.