Работа № 31 Определяне на алфа-амилазната активност по метода на Каравей
Метод принцип. Методът се основава на колориметричното определяне на концентрацията на нишесте преди и след неговата ензимна хидролиза.
Реактиви
1. Разтвор на субстрата рН 7,2-7,4. 13,3 g безводен двузаместен натриев фосфат и 4,3 g бензоена киселина се въвеждат в 250 ml дестилирана вода, доведена до кипене, и разтворът се вари известно време. Суспендирайте 0,2 g "разтворимо" нишесте в малко количествостудена вода и се изсипва във врящата смес, поддържа се в това състояние в продължение на 1 мин. След това сместа се охлажда и се довежда до 500 ml с вода.
Разтворът е стабилен при стайна температура, но е препоръчително да се приготвя отново на всеки два дни или 2 пъти седмично. Той трябва да си сътрудничизапазете прозрачност. Обърнете специално внимание на рН на подготвения субстрат (трябва да бъде поне 6,8). За да доведете рН на разтвора до необходимите стойности (7.2-7.4), можете да промените съотношението между количеството, използвано за приготвянето муотстраняване на натриев фосфат и бензоена киселина или, в случай на киселинен разтвор, добавяне на 5 N разтвор на NaOH.
2. 0,1 N основен разтвор на йод, който може да бъде получен по следните начини: а) от фиксирания канал; б) от кристален йод и йодид калиа: 30 g KI се разтварят в 250 ml дестилирана вода, добавя се 12,7 g йод и обемът се довежда до 1000 ml с дестилирана вода. Полуразтвореният разтвор (Lugol's) се съхранява на тъмно, той е стабилен; в) от калиев йодат и калиев йодид: 3,567 g калиев йоден киселина (KIOs) и 45 g KI разтворизсипва се в 800 ml вода и бавно, при разбъркване, се добавят 9 ml концентрирана солна (солна) киселина и след това дялвода до 1000 мл.
4. Работен (0,01 N) йоден разтвор. 25 g калиев флуорид се разтварят в 350 w вода, инжектирайте 50 ml основен разтвор на йод и допълнете с вода до обем 500 ml. Срокът на годност на разтвора е около 2 месеца, при условие че се съхранява в съдове от тъмно стъкло в хладилника. Ежедневно трябва да се приготвя работен разтвор на йод, без да се добавя калиев флуорид.
Напредък в определянето 1 ml разтвор на нишесте се добавя към обикновена химическа епруветка, субстратът се загрява в продължение на 5 минути на водна баня при 37 ° C, след което към него се добавят 0,02 ml нехемолизиран серум. Опитайте отново pomeпоставете във водна баня за точно 5 минути (за това в термостат със сух въздух трябва да има буркани с вода). Контролната проба се извършва по същия начин като експерименталната, но серумът не се добавя към нея. След това към всички епруветки се добавят 1 ml йоден работен разтвор и 8 ml дестилат (експериментални и контролни)вода, епруветките се разклащат добре и разтворът се съдържа в тяхry колориметрия на всеки фотометър, например FEC, с червена светлинас горен филтър (630-690 nm) в кювета с ширина на слоя 10 mm. Когато се вземе предвид оптичната плътност на пробите, като решение за сравнение се използва дестилирана вода. Изчислява се активността на алфа-амилазата в g разцепено нишесте на 1 литър серум за 1 час инкубация при +37 "С, съгласно формулата: