Пространствено количествено определяне на лекарствата при лезии на белодробна туберкулоза чрез микродисекция с лазерно улавяне

Обобщение

Тук ние описваме протокол, използващ микродисекция с лазерно улавяне, съчетана с LC/MS анализ за количествено определяне на пространственото разпределение на лекарството в грануломите на белодробната туберкулоза. Този подход има широка приложимост за количествено определяне на концентрациите на лекарства в тъканите при високи пространствени детайли.

Резюме

Въведение

Способността за пространствено разрешаване и количествено определяне на нивата на лекарствата е от съществено значение за определяне дали антитуберкулозните лекарства достигат до бактериални субпопулации в белодробните лезии при стерилизационни концентрации 1. От особено значение е проникването на лекарството в некротичното ядро на лезията (наречено казеум), като се определя, което обикновено съдържа най-голям брой бацили и евентуално лошо достъпни лекарства поради липса на васкуларизация.

Традиционните методи за проникване на лезии, оценяващи хомогенизацията на изрязаните белодробни лезии, последвани от екстракция с разтворител и анализ на течна хроматография-масова спектрометрия (LC/MS), са много чувствителни и селективни за лекарствата от интерес. Тези методи обаче предоставят лоша пространствена информация, ограничена до размера на оригиналната хомогенизирана тъкан. Подходи за изобразяване въз основа на масова спектрометрия като матрично подпомагана лазерна десорбционна йонизация (MALDI) 2, 3, десорбционна йонизация с електроразпръскване (DESI) 4 или екстракция на повърхност с разширена течност 5, 6 предлагат много пространствено разрешени възможности за изобразяване, но директното количествено определяне може да бъде изключително трудно или невъзможно поради хетерогенните ефекти на потискане на йони и различна ефективност на екстракция на аналити от отделната клетка или тъкан 7. В допълнение, повечето подходи за директно изобразяване на тъканни MS са по същество по-малко чувствителни от LC/MS поради липсата на хроматографско разделяне на ендогенни видове, конкуриращи се за йонизация и по-ниската ефективност на екстракция на лекарството от тъкан с разтворител.

Този протокол описва мощната комбинация от пространствено профилиране и цялостно количествено определяне на LCM-LC/MS, предлагайки абсолютни концентрации на лекарства във всички отделения на предлаганите грануломи за туберкулоза. Техниката може също така да се прилага за определяне на концентрациите на лекарства в много различни болни тъкани, за да информира за откриването и развитието на жизненоважно лекарство.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Всички тестове върху животни са извършени в съответствие с Ръководството на Националния институт по здравеопазване за грижи и употреба на лабораторни животни с разрешение от институционалния комитет за грижа и употреба на животните на NIAID (NIH), Бетесда.

(1) Тестване върху животни и събиране на тъкани

Този раздел на протокола описва процедурите за животни и условията за събиране на проби от ниво 3 на биобезопасност (BSL3). За подробни протоколи от процедурата за аерозолна инфекция с Mycobacterium Tuberculosis и администриране на лекарства, протоколите при зайци са описани по-рано 11, 12 .

(4) Извличане и анализ на LCMS

5. валидиране на метода

Създайте хомогенат в контрола на белодробната тъкан, като комбинирате 1 част от белия дроб, 2 части PBS и 3-4 стоманени топчета. Разбийте белодробната тъкан и PBS буфера за 5 минути при 1750 об/мин с хомогенизатор на зърна.
Добавете хомогената, като добавите 10 µL от 1 mg/mL етамбутол DMSO в 990 µL хомогенат, за да създадете крайна концентрация от 10 000 ng/mL (10 mg/mL) и завихрете за 1 минута.
Създайте замразен хомогенатен блок, като излеете хомогената в Cryomold и бързо го замразите върху сух лед за 5 минути.
Пригответе участъци с дебелина 25 µm от хомогенатния блок, както е описано в 2.1-2.5.
Дисектирайте целевата тъкан, както е посочено в стъпки 3.2-3.10.
Добавете 10 µL 1: 1 ацетонитрил/вода и 2 µL PBS буфер към епруветките с микродисектирана тъкан.
Добавете 50 µL от екстракционния разтвор към всяка епруветка. Стъпки за създаване на стандартна крива и определяне на концентрацията на лекарството в тъканния хомогенатен блок 4.9-4.12.
Изчислете ефективността на извличане, като използвате следната формула:

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Преглед на подхода LCM-LC/MS е показан на фигура 1показани. След като тъканта е стерилизирана чрез гама облъчване, всички по-нататъшни стъпки (отрязване на тъкани) се извършват извън условията на BSL3. Фигура 2 показва секциите на биопсията на лезиите преди и след тъканта, изолирана от LCM. Некротичните и клетъчни области на туберкулозните лезии могат лесно да бъдат идентифицирани и изолирани само чрез визуална проверка на оптичните изображения (без да е необходимо да се отнасят до съседни тъканни хистологично оцветени участъци). Процесът на дисекция създава чист разрез с минимално разрушаване на околната тъкан и дисекцията на 3 милиона µm 2 (3 mm 2) от всеки интересен регион от лезии отнема общо около 1 час.

Приложихме LCM-LC/MS пространствено количествено определяне - много съществуващи и нови лекарства против туберкулоза в белодробни лезии. Фигура 3А показва примерни данни от заразени с MTB зайци, дозирани в стационарно състояние с етамбутол. LCM-LC/MS дава възможност за пълно количествено определяне на лекарството, разтворено в казеума, клетъчните лезии и неангажираните области на белодробната тъкан. Наблюдавано е, че ЕМВ прониква през лезията, за да достигне стерилизационна концентрация в некротичния казеум. Съответното изображение на MALDI-MS, получено чрез продажби на EMB от съседна тъкан, е показано на Фигура 3b. Качествените MALDI-MS изображения корелират добре с количествените LCM-LC/MS данни с по-ниски концентрации на лекарството, открити в некротичния казеум в сравнение с клетъчната джанта. Данните от LCM-LC/MS бяха валидирани чрез директно сравнение с тъканни хомогенати, анализирани чрез стандартен LC/MS.

илюстрация 1 : Схематичен процес LCM-LC/MS. Биопсии на бели дробове на зайче с некротични лезии, заедно с необградените бели дробове се събират и замразяват. Криосекциите се нарязват на тънки PET мембрани и неангажираните белодробни, клетъчни и казеозни лезии се дисектират и изолират за количествено определяне чрез LC/MS. адаптиран от Zimmerman et al. 12 Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

Фигура 2 : Лезия (A, B) и неангажиран бял дроб (C, D), тъй като се появяват под микроскопа преди (A, C) и след (B, D) микродисекция. Областите на казеозните лезии изглеждат по-тъмни и „напукани“ при сканирането на оптично изображение (A, зелен контур). Клетъчната лезия е по-светла на цвят и има по-твърда структура (А, червена граница). Неангажираните бели дробове трябва да се палпират на поне 5 mm от границата на лезията и да изглеждат червено/розови на цвят (C, циански контур). Мащабиращи ленти (черно, синьо и лилаво) = 400 µm. Обърнете внимание, че трябва да бъдат избрани само участъци от необхванати бели дробове, за да се избегне включването на алвеоларните пространства и бронхиолите, уловени в цялата повърхност на тъканта (вж. Г). Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.

Разчленена площ (µm - 2)	EMB конц. (Ng/g) измерена (n = 3)	Възстановяване на EMB (%) (n = 3)
3 милиона	10633 (± 404)	106 (± 4)
5 милиона	10057 (± 1132)	101 (± 11)
10 милиона	10563 (± 1128)	105 (± 11)

Маса 1: Ефективност на екстракция на метода LC-LC/MS за количествено определяне на ЕМВ в белите дробове. Пълното възстановяване на EMB регистрира EMB-допиран хомогенат дисектирана белодробна тъкан за всички оценени обеми тъкан.

Заек ID	LC/MS EMB (ng/g)	LCM-LC/MS EMB (ng/g)	Разлика (%)
899	2910	3320	14-ти
904	2010 г.	1870	-7-ми
911	2150	2370	9

Таблица 2: Сравнение на количественото определяне на EMB на неангажирани белодробни биопсии от 3 дозирани зайци, използващи LCM-LC/MS. и LC/MS Концентрирани еквивалентни лекарствени концентрации, открити чрез методи и не се наблюдава загуба на сигнал при разграждане или аспирация по време на LCM-LC/MS процеса.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Дискусия

Необходимо е пространствено разрешено количествено определяне на лекарствата в белодробните туберкулозни лезии, за да се определи дали експозицията на лекарството достига стерилизиращи концентрации на бактериални популации, пребиваващи в различните лезионни отделения. Методът LCM-LC/MS, описан тук, дава възможност за абсолютна количествена оценка на антитуберкулозните лекарства при всички субекти на поражението, включително богатия на бактерии казеум, с общо 1-3 тъканни среза. Традиционната тъканна хомогенизация и LC/MS подходи за количествено определяне на лекарството в тъканите често нямат пространствени характеристики за справяне със специфични отделения на лезиите и дори когато е възможно, съществува значителен потенциал за кръстосано замърсяване и зони на некротични лезии по време на ръчна екстракция.

Протоколите за оцветяване на тъкани обикновено се използват преди LCM за протеомични приложения, за да позволят лесно идентифициране на областите на тъканите и разположени в клетъчни популации. Рутинни хистохимични петна като Б. H&E не са съвместими с количественото определяне на лекарството, тъй като много от участващите етапи на измиване с разтворител биха отвели лекарството от секцията на тъканта в друга. Съседните заготовки могат да бъдат оцветени с H&E и да се използват като ръководство за микродисекция. Това обаче обикновено не е необходимо, тъй като отделенията на лезиите могат да се разглеждат под стандартния LCM светъл полеви микроскоп (Фигура 2) може да бъде решен.

Оптимизирането на стъпките на рязане и микродисекция е от решаващо значение за успешното количествено определяне на лезиите. По време на разработването на метода ние оценихме два различни мембранни материала, полиетилен терефталат (PET) и полиетилен нафталат (PEN), като субстрати за сглобяване на тъканните секции за микродисекция. PEN мембраните са претърпели увеличени статични заряди в сравнение с PET мембраните и приблизително 30% от всички разсечени тъканни области са загубени поради статично привличане между мембраната и разчленената тъканна област. Поради тази причина PET мембраните бяха избрани за бъдещи дисекции поради значително намаленото наблюдавано статично привличане (само 5% от областите, разчленени от PET мембрани бяха загубени по време на LCM).

Плътността на разчленените тъканни области също е важно съображение при количественото определяне на нивата на лекарството въз основа на площта или обема на тъканта. Това е от особено значение за биопсиите на белите дробове и лезиите, при които неангажираните области на белодробната тъкан имат обща по-ниска плътност от клетката и казеума (по-малко тъкани, които имат еднаква относителна площ) поради наличието на множество отворени бронхиоли и алвеоларни пространства. Ефектите от тази разлика в плътността могат да бъдат смекчени чрез внимателно оглеждане на откритите площи, включително включването им в натрупаната площ на събраните тъкани (както е показано на фигура 2показано).

Друго ограничение е, че представеният метод LCM-LC/MS само количествено определя общата концентрация на лекарството в изолираната тъкан (заедно с всички подходи за хомогенизиране на тъкани, екстракция с разтворител и количествено определяне на LC/MS) и не разтваря свързаните с протеини концентрации на лекарства от несвързани прекъсвания. Микродиализата е алтернативен подход за количествено определяне на несвързаното лекарство в тъканите и дава възможност за точно количествено определяне на концентрациите на свободно лекарство, достигащи извънклетъчни популации на бактерии 13. Техниката обаче би била най-добре да се прилага като допълващ подход, тъй като в нея липсват пространствените специфики на LCM-LC/MS и количествено се определят нивата на разтворими лекарства в йерархията на извънклетъчната тъкан, а не вътреклетъчното съдържание.

За първи път сме комбинирали LCM и LC/MS, за да определим количествено количествено антибиотици на мястото на туберкулозната инфекция. Методологията е изключително мощна, тъй като може да бъде приложена към всяко лекарство с малка молекула на всеки стадий на заболяването. Всъщност наскоро определихме количествено кандидата за противогъбично лекарство в миши модел на коремна кандидоза 14. Диференциалното разделяне на лекарства в хетерогенни туморни отделения (включително некротични ядра) е основна грижа при лечението на рака и критична област на изследванията за откриване на лекарства за рак 15. LCM-LC/MS е идеално подходящ за подход към тези въпроси. В допълнение, LCM-LC/MS е полезен за откриване на биомаркери за количествено определяне на метаболитни, липидомични и протеомични промени, настъпващи в тъканни области и клетъчни популации по време на патогенезата на заболяването.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.