Прилагане на маркери на микрочастици за изучаване на храносмилателната физиология на Брахион
Приложение на маркери на микрочастици за изследване на храносмилателната физиология на Brachionus plicatilis (Rotatoria) INAUGURAL DISSERTATION за получаване на докторска степен на Факултета по математика и естествени науки в Университета в Кьолн, представена от Никол Анита Линдеман от Дуйсбург Кьолн 2001
Докладчик: проф. Д-р W. Kleinow проф. Д-р М. Дамбах проф. Д-р H. Arndt Ден на устния изпит: 11 май 2001 г.
Съдържание 3.2.4 Влияние на факторите на средата върху преминаването на храна 96 3.2.4.1 Микроскопско изследване на стойността на ph в стомаха и червата на B. plicatilis 96 3.2.4.2 Влияние на стойността на ph в средата 102 3.2.4.3 Сравнение на скоростите на поглъщане и филтрация в буферирана среда 105 3.2.5 Изследване на абсорбционните процеси в храносмилателния тракт на B. plicatilis 116 3.2.5.1 Абсорбция на хемоглобина 116 3.2.5.2 Директно откриване на абсорбцията на протеини 121 3.3 Заключителни бележки и обща дискусия 125 4. Резюме 130 5. Библиография 132 Благодарности Обяснение продължи
Резюме Съдържанието на храносмилателния тракт на B. plicatilis може бързо и лесно да се обменя чрез въвеждане на нов тип частици в средата. Клетките на дрождите са използвани за заместване на еритроцитите в храносмилателния тракт и за изследване на способността на ротиферите да контролират поглъщането на хранителни частици. Използването на оцветени с бромотимол сини дрожди клетки дава възможност да се определят разликите в ph стойностите на стомаха и червата. Освен това при експерименти с хранене тези клетки са полезни за изследване на разликите в секрецията на H + йони от червата в хранителна среда с различна моларност. И накрая, абсорбиращи процеси могат да бъдат демонстрирани чрез заместване на маркирани с флуоресценция еритроцитни призраци с немаркирани призраци и откриване на дълготрайна остатъчна флуоресценция в стомашните клетки. 2
Материал и методи 2. Материал и методи 2.1 Често използвани съкращения DTT FITC HEPES LSM MES RSA SDS TRA Tris rpm 1,4-Dithio-DL-Threit (ol) Флуоресцеин Изотиоцианат N-2-Хидроксиетилпиразин-N -2-етансулфонова киселина Лазерно сканиране -Микроскоп N-морфолин етансулфонова киселина говежди серумен албумин натриев додецил сулфат триетаноламин хидрохлорид tris (хидроксиметил) аминометан обороти в минута 5
Материал и методи 2.2 Производител на химикали, вещество Степен на чистота Appli Chem (Дармщат) Албумин от говежди серумен цитрат (лимонена киселина монохидрат) стр. а. DTT MES буферно качество натриев хидроксид p. а. Солна киселина p. а. TRA стр. а. Boehringer (Mannheim) Tris кристален Merck (Darmstadt) бромотимол син бромофенол син разтвор на глутаралдехид 25% калиев хлорид p. а. Калиев хидроген фосфат p. а. Калиев хидроксид чист магнезиев сулфат 7-хидрат p. а. Натриев карбонат p. а. Натриев хлорид p. а. Натриев дихидроген фосфат 1 хидрат p. а. Натриев хидроген карбонат p. а. динатриев хидроген фосфат дихидрат p. а. Смес от морска сол на натриев дитионит Sera (Heinsberg) 6
Материал и методи Производител, вещество Ниво на чистота Серва (Хайделберг) Хлорамфеникол Хепарин SDS Захароза (захароза) изследователски клас изследователски клас кристална Сигма (Мюнхен) FITC HEPES Литиказа (от Arthrobacter luteus) Мертиолат (Timerosal) Riedel-de-Haën (Хановер чист) Амониев хидроген карбонат Хеновер водороден карбонат Амониев хидроген карбонат Неизброените химикали идват (с качествено качество) от Merck, Дармщат. Освен ако не е посочено друго, използваните разтвори се смесват с Aqua bidest. планиран. 7-ми
Материал и методи 2.3 Специални материали МАРКА (Wertheim/Main) Хепаринизирани микро хематокритни капиляри (дължина: 75 ± 1,00 mm; вътрешен диаметър: 1,15 ± 0,05 mm; външен диаметър: 1,55 ± 0,05 mm), Камера за преброяване, Neubauer (дълбочина на камерата: 0,1 mm; мрежа за преброяване: 9 големи квадрата на всеки 1 mm 2) BRAUN (Melsungen) стерилни кръвни ланцети, Solofix CORNING COSTAR GmbH (Bodenheim) Tanswell-Clear полиестерна мембрана (диаметър 24 mm, размер на порите 0,4 µm) PLANO (Wetzlar) Prep-Eze: кошница (тип A) с размер на отворите 75 µm ROTH (Karlsruhe) диализна тръба, изработена от целулоза, Spectra/Por Membrane 3, MWCO: 3 500 работилница на филтърния апарат на Zoological Institute (University of Cologne) (Lindemann & Kleinow, 2000), вижте фигура 1, състояща се от PE тръба с плътно запечатан печат и два затварящи се изхода. Печатът е покрит с марка Polymon (PES 16/5, Schweizer Seidengazefabrik AG Zurich, размер на окото 16 µm). Малък филтриращ апарат, направен от стъклена спринцовка FORTUNA OPTIMA от 5 ml (Walter Graf and Co. GmbH & Co., Wertheim) с покрита с марля (Polymon Gaze PES 16/5, Schweizer Seidengazefabrik AG Zurich, размер на окото 16 µm) PE печат; Изходът на спринцовката може да се затвори с гофриране на маркуч. 8-ми
Материал и методи 10 cm B A C Фиг. 1: Филтриращ апарат за концентриране на ротифери или за отстраняване на малки частици (еритроцити, водорасли или клетки от дрожди) от средата, съдържаща ротифер. Плътно запечатан печат, покрит с марля Polymon (размер на окото 16 µm) B дренаж за миеща среда C дренаж за концентрирани ротифери без частици 9
Материал и методи 2.4 Методи за микроскопско наблюдение 2.4.1 Светлинен микроскоп Използвани са следните: а) Светлинен микроскоп на Laborlux K (Leitz, Wetzlar, увеличение между 40 и 1000). б) Микроскоп за заден ход на Wilovert (Will, Wetzlar, увеличение между 40 и 320). 2.4.2 Флуоресцентен микроскоп Изследванията на флуоресценцията се извършват върху флуоресцентен микроскоп Orthoplan (Leitz, Wetzlar, увеличения 63-400) с възбуждащ филтър L2 450-490 (сплитер 510, блокиращ филтър 525/20). Животните са наблюдавани на микроскопски диапозитиви под покривни стъкла. 2.4.3 Микроскопски изображения Светлинните микроскопски изображения са направени с рефлекторна камера Minolta X-300 с приставка за лещи Leitz Periplan (GF 12,5; TL 160 mm 10). Използвани са следните филми: Ilford PAN F Plus 50 ASA (черно-бял отрицателен филм), Kodak EKTAR 100 ISO 100/21 (цветен отрицателен филм), Kodak EKTAR 1000-2 (цветен отрицателен филм), Kodak Royal Gold 100 ISO 100/21 (цветен отрицателен филм ), Scotch CHROME 640-T ISO 640/29, 3200 k (цветен слайд филм за лампа с нажежаема жичка). За компенсиране на лекия жълт оттенък, причинен от изкуствената светлина, беше използван син филтър. 10
Материал и методи 1 2 Фиг. 2: Уредба за наблюдение на отделни животни за по-дълъг период от време. Животните, задържани на място с помощта на стъклен капиляр Pyrex (), се наблюдават в хранителната среда чрез обърнат микроскоп. Стъкленият капиляр се държи и ръководи от микроманипулатор. Отрицателното налягане в задържащата капиляра се проверява с помощта на спринцовка от 2 ml (). 1 = микроманипулатор, 2 = плъзгач с приставка от 1 ml. 16.
Материали и методи 2.5.4 Имобилизиране на ротифери с натриев дитионит С цел микроскопско изследване на голям брой ротифери, животните бяха имобилизирани с натриев дитионит. 500 μl ротори, съдържащи среда, се инжектират в реакционен съд на Eppendorf с 500 μl натриев дитионит (40 mg/ml). След обработката ротиферите потъват на дъното на съда в напълно удължено състояние. За да се определи общият брой на животните и броят на животните с напълнен (червено оцветен) храносмилателен тракт, в зависимост от концентрацията на ротиферите, 20-100 μl са пипетирани от съда върху куха стъклена стъклена пързалка. 2.5.5 Производство на буфер за разтваряне Производството на von Kleinow et al. (1991) разработен буфер за разтваряне се случи, както следва: В 2 ml дестилирана вода. 0.18 М SDS и 0.03 М амониев хидроген карбонат бяха разтворени (рН 8). Преди началото на експеримента към разтвора се добавят 0,04 g DTT. 17-ти
Материал и методи 2.6.4 Призраци на еритроцитите 2.6.4.1 Приготвяне на FITC албумин (Wißling, 1988 и Johnson & Halborow, 1986) За да се предотврати дифузията на флуоресцентното багрило от призраците, то се свързва с протеини: с 0,5 M повече Буфер (рН 9,5) се осигурява чрез добавяне на 5,8 ml от 5,3% разтвор на Na2C03 към 10 ml от 4,2% разтвор на NaHCO3. 50 mg албумин се поглъщат в 4,5 ml 0,9% разтвор на NaCl и се прибавят 0,5 ml от алкалния буфер, след цялостно разбъркване се прибавят 1,5 mg FITC и разтворът се разбърква при 22-25 ° С в продължение на 2 часа. Тази смес се диализира за една нощ срещу 4 1 физиологичен разтвор на сол в диализен клапан. Готовият флуоресцентно-протеинов комплекс се съхранява на хладно и тъмно място. 2.6.4.2 Разтвори Измиващ разтвор: хипосмотичен буфер: Промивен буфер: 0,9% разтвор на NaCl 5 mm MgSO 4 разтвор 160 mm KCl/5 mm разтвор HEPES, pH 7,4 Всички разтвори бяха използвани за приготвяне на призраци до приблизително C охладено. 2.6.4.3 Производство на ненатоварени и натоварени призраци Прясна хепаринизирана кръв от бозайници (овце или говеда) се центрофугира при 5000 об/мин при 4 ° С в продължение на 10 минути. След декантиране на плазмената супернатанта и горния левкоцит-съдържащ слой на клетъчната колона, Sedi-20
Материал и методи 2.6.4.4 Фиксирани с глутаралдехид призраци Натоварените призраци се приготвят и фиксират, както е описано в раздели 2.6.3 и 2.6.4, като разтворът на глутаралдехид се добавя към подготвените и охладени призраци без предварително измиване . 22-ри
Материал и методи Филтърна кошница за вземане на проби Rotifers Еритроцити Фиг. 3: Схематично представяне на пробите: За фотометричните измервания пробата се пипетира от филтърна кошница, която е достъпна за еритроцитите, но не и за ротификаторите. Това беше постигнато чрез залепване на 2-3 тъканни кошници (размер на окото 75 µm, Plano GmbH Wetzlar). През първия час се взема проба на всеки 5-10 минути, в по-нататъшния ход на теста само на всеки 20-30 минути. Когато се вземат пробите, 2 ml се пипетират от филтърната кошница в кювета. За да се гарантира, че суспензията във филтърната вложка приблизително съответства на концентрацията на еритроцитите или освободения хемоглобин в околната среда, съдържанието на филтърната кошница се прехвърля няколко пъти с помощта на пипета във външната среда преди вземането на всяка проба. 24
Материал и методи 2.7 Приготвяне на дрождените клетки 2.7.1 Производство на суспензия от дрожди 0.5 g хлебна мая (Saccharomyces cerevisiae) се разбъркват в 100 ml морска вода, докато дрождите се разпределят равномерно. 2.7.2 Приготвяне на фосфатния буфер съгласно Sørensen 0,2 М фосфатен буфер рН 7,0 се приготвя чрез комбиниране на 30,5 ml 0,2 M Na 2 HPO 4 разтвор и 19,5 ml 0,2 M NaH 2 PO 4 - Направено решение. Получихме 0,067 M буфер на Sørensen чрез разреждане на 6,7 части от буфера с 13 части дестилирана вода. (Dawson et al., 1969). 2.7.3 Приготвяне на калиев фосфатен буфер KH 2 PO 4 (0,05 М) се разтваря в дестилирана вода. приготвен и регулиран до рН 7 с КОН. 2.7.4 Оцветяване на дрождените клетки с индикаторно багрило Вместо дрождените клетки от "Preis Microplan", използвани от Klaus Kühle (1983), са използвани пресни хлебни дрожди, за да може първият етап на центрофугиране да бъде пропуснат. Бяха проведени следните стъпки за оцветяване на дрождните клетки с индикаторно багрило: Суспендиране на 250 mg прясна хлебна мая в епруветка в 5,0 ml 1/15 M фосфатен буфер (Sørensen) pH 7,0. - Добавяне на 25 mg бромотимолово синьо (диапазон на индикатора рН 6,0-7,8; промяна на цвета от жълт (кисел) към син (основен)) или бром - 26
a b c d Фиг. 4a-d: Приемане и предаване на еритроцити в храносмилателния тракт на B. plicatilis. Типична последователност след добавянето на еритроцити в момент 0, наблюдавана на ротифер, който се задържа при отварянето на стъклен капиляр Pyrex чрез засмукване. При това увеличение не беше възможно да се снима цялото животно на фокус. Поради движението на животните в средата трябваше да се изберат кратки времена на експозиция с голяма бленда. Калибрираща лента = 100 µm. а) След 10-20 секунди стомахът става леко червен на цвят. б) След 180 секунди стомахът е явно пълен и може да се види първият цвят на червата. в) След 15 минути стомахът и червата са с интензивно червен цвят. г) След 17 минути съдържанието на червата се изхвърля през ануса. Процесите на преминаване след първия процес обикновено се ускоряват, така че следващата евакуация на червата се извършва само след 10 минути. Във всички използвани еритроцити на бозайници (хора, говеда и овце) във фекалиите се виждат само мембранни фрагменти и червеният цветен облак, състоящ се от освободения хемоглобин, който бързо се разпространява в средата. В отделни случаи, които все още са видими при изпразване на червата за първи път, 30
Ако такива проблеми могат да бъдат решени, използването на духове, пълни с флуорогенни ензимни субстрати, би било възможно за по-нататъшни изследвания. Този метод може да се използва напр. Локализирайте ензимите в храносмилателния тракт. a b Фиг. 5a-b: Ярко поле и флуоресцентна фотография на ротифер 5 минути след захранване с призраци, пълни с маркиран с FITC албумин (калибрираща лента = 50 µm). 50 μl суспензия с призраци FITC албумин бяха добавени към 500 μl среда, съдържаща ротифери. След като погълнаха частиците в продължение на пет минути, ротиферите се освободиха от свободни призраци на флуоресценция, като ги изплакнаха няколко пъти в 16-милиметров найлонов филтър и животинска проба беше прехвърлена на предметно стъкло с капак. а) Флуоресцентно изображение, б) За да локализира флуоресценцията в храносмилателния тракт, изображение а е обърнато и поставено върху ярко полево изображение на същото животно. 33