Поведенчески фармакологични и молекулярно-биологични проучвания за отнемане на опиати при плъхове -
Поведенчески фармакологични и молекулярно-биологични изследвания за отнемане на опиати при плъхове Дисертация на Биологическия факултет на Университета „Лудвиг Максимилиан“ в Мюнхен, Зоологически институт, Катедра по невробиология, представена от Dipl.-Biol. Кристиан Киршке на 31 октомври 2001 г.
Първи доклад: Втори доклад: Специален доклад: проф. Д-р Райнер Ландграф проф. Д-р Петер Шлегел проф. Д-р Ден на устния изпит на Rainer Spanagel: 17 юни 2002 г.
Съдържание 1. Общо въведение 3 2.1. Въведение [S 35] -GTPγS проучване за авторадиография 11 2.2. Материал и методи [S 35] -GTPγS проучване за авторадиография 17 2.2.1. Животни и животновъдство 17 2.2.2. Процедура за изпитване и дизайн на група 17 Експеримент 1 17 Експеримент 2 18 Експеримент 3 19 2.2.3. Избор на мозъчните области 19 2.2.4. [S 35] -GTPγS авторадиография 21 2.2.5. [H3] -DAMGO проучване за свързване 22 2.2.6. Оценка и статистика 23 2.3. Резултати [S 35] -GTPγS проучване за авторадиография 25 Експеримент 1 25 Експеримент 2 31 Експеримент 3 35 2.4. Дискусия [S 35] -GTPγS проучване за авторадиография 37 3.1. Въведение в концепцията за ниски дози налоксон 42 3.2. Материал и методи Ниска доза налоксон концепция 46 3.2.1 Животни и животновъдство 46 3.2.2 Морфинови гранули 46 3.2.3. Експерименти на открито 47 Прилагане на ниски дози налоксон остър 47 Сенсибилизация 48 3.2.4. Експерименти в кутии на Скинър 49 дискриминация на наркотици 49 Оттегляне на опиати в кутии на Скинър 50 3.2.5. Експеримент в кутии за наблюдение 51 3.2.6. Оценка и статистика 52 3.3. Резултати от концепцията за ниски дози налоксон 54 Морфинови пелети 54 Експерименти на открито 55 Експерименти в кутии на Скинър 58 Експерименти в кутии за наблюдение 61 3.4. Дискусия на концепцията за ниски дози налоксон 63
4.1. Индукция на условно оттегляне 68 4.2. Материал и методи за условно оттегляне 74 4.2.1 Животни и животновъдство 74 4.2.2. Животински модел на условно оттегляне 75 4.2.3. Експеримент на открито 77 4.2.4. Тест за хипералгезия (котлон) 77 4.2.5. Измерване на хормоните на стреса 77 4.2.6. Сравнение на животинския модел с парадигмата на стреса 78 4.2.7. in situ хибридизация 79 4.2.8. Интервенция от мемантин 82 4.2.9. Оценка и статистика 82 4.3. Резултати от условно отнемане 83 Част 1: Животински модел за измерване на условни симптоми на отнемане 83 Част 2: хибридизация in situ 96 Част 3: Фармакологична интервенция с използване на мемантин 99 4.4. Дискусия на условното оттегляне 106 Част 1: Животински модел за измерване на условни симптоми на отнемане 106 Част 2: In situ хибридизация 109 Част 3: Фармакологична интервенция с използване на мемантин 111 5. Заключение 113 6. Библиография 116 Благодарности 131 Автобиография 132
Все още няма знания за активността на свързаните с μ-опиоиден рецептор G протеини при отнемане, така че въпросът до каква степен излишната невронална активност при отнемане се влияе от G протеините и тяхната функционалност не е изяснен. Следователно целта на това проучване е да изследва активността на G-протеини, свързани с µ-опиоиден рецептор при отнемане, като се вземат предвид различни параметри. Методът на изследване е този на Sim et al. (1995) допълнително разработи [S 35] -GTPγS авторадиография, която дава възможност за извършване на това измерване на активността върху до голяма степен непокътнат участък на мозъка и в същото време да се определи точна анатомична локализация на тази дейност. Това също така дава възможност за извършване на по-нататъшни методи за молекулярно биологично изследване (например изследване за свързване на лиганд) на същия мозък, за да се открият всякакви разлики във взаимодействието между свързването на рецептора и активирането на G протеина. 16.
10 10 +5 +5 0 0 -5 -5 -10 -15 -10 Bregma-15 0 Bregma 0 5 5 5 5 0 Interaural 10 0 Interaural 10 +15 +10 +5 0 -5 +15 +10 +5 0 -5 Nucleus accumbens Interaural 10.60 mm Bregma 1.60 mm 10 10 +5 +5 0 0 -5 -5 -10 -15-10 Bregma-15 0 Bregma 0 5 5 5 5 0 Interaural 10 0 Interaural 10 +15 +10 +5 0-5 +15 +10 +5 0-5 LV Централно ядро на амигдала II Интерактивно 6.70 mm Bregma -2.30 mm 10 10 +5 +5 0 0-5 -5-10 -15-10 Bregma-15 0 Bregma 0 5 5 5 5 0 Interaural 10 0 Interaural 10 +15 +10 +5 0-5 +15 +10 +5 0-5 Locus coeruleus Nucleus parabrachialis Interaural -0.80 mm Bregma -9.80 mm Фиг. 4: Илюстрация и позиция на изследваните мозъчни области. Представяне, модифицирано от Paxinos and Watson (1998) 20
2.2.6. Оценка и статистика Оценка на [S 35] -GTPγS авторадиография и статистика: Разработените филми са цифровизирани с помощта на видеокамера (Sony XC-77) и оценени с помощта на компютър (Optimas, BioScan). Степента на почерняване на отделните мозъчни области се записва с помощта на денситометрия и радиоактивността [S 35] се определя чрез сравняване на приложен стандарт [C 14] (NEN) и изчислен коефициент на преобразуване. Резултатът се изразява в nci/g. Коефициентът на преобразуване се изчислява чрез отлепване на инкубираните секции от предметните стъкла, определяне на теглото и определяне на радиоактивността в течна сцинтилаторна фотометрия. Коефициентът на преобразуване се изчислява от нивата на сивото и прилагания стандарт [C 14] въз основа на резултатите от течната сцинтилационна спектрофотометрия. Получените данни са отчетени като групова средна стойност ± стандартна грешка (SEM). Статистическите изчисления бяха извършени с помощта на двуфакторен дисперсионен анализ (ANOVA, фактор А: стимулация базално измерване спрямо DAMGO стимулация, фактор В: групи). Тестът на Newman-Keuls беше използван като последващ post hoc тест. Ако вероятността за грешка p