Подкожната инфузия на ангиотензин II с помощта на осмотични помпи предизвиква аортни аневризми при мишки протокол

Обобщение

Подкожната имплантация на осмотични помпи осигурява удобен подход за по-дълго и по-последователно доставяне на връзката. Този подход се използва широко за изследване на аневризми на коремната и гръдната аорта при мишки.

Въведение

Аортните аневризми показват трайно увеличаване на лумена на аортата, което предполага разкъсване и обикновено води до смърт. Това заболяване се среща както в коремната, така и в гръдната аортна област, които се наричат ​​съответно аневризми на коремната аорта (AAA) и аневризми на гръдната аорта (TAA). Поради непълно разбиране на молекулните механизми и патофизиологичните процеси, няма доказана медицинска терапия, която да предотврати разширяване или разкъсване на който и да е от аортните аневризми. Тъй като е трудно да се вземат проби от пациенти и да се провеждат директно експерименти с хора, изследванията, фокусирани върху определянето на механизмите на AAAS, често са екстраполирани от животински модели. Често използван животински модел е подкожната инфузия на ангиотензин II (AngII) в мишки. В сравнение с други хирургически подходи за индуциране на ААА при мишки, като например перфузия на интрааортна еластаза или периаортно приложение на калциев хлорид, които изискват лапаротомия 1,2, този метод не изисква влизане в телесната кухина и изисква минимално хирургично умение 3,4.

Инфузията на AngII при мишки води до дълбоко разширяване на гръдната аортна област, която се ограничава най-вече до възходящата аорта, която е най-честата област за TAA при хората 19,22-26. Подобно на индуцираните от AngII AAA, TAAs, индуцирани по време на инфузия на AngII, също рекапитулират много функции на човешки TAAs 25. Въпреки това, за разлика от AngII-индуцираните AAA, AngII-индуцираните TAA не са свързани с хиперхолестеролемия и нямат полови разлики.

Общата цел на подкожната инфузия на AngII при мишки е да се изследват патологичните особености и молекулярните механизми на AAAS и TAA.

Протокол

Декларация за етика: Изследванията на мишки се провеждат с разрешение от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните в Университета на Кентъки (номер на протокола на IACUC: 2006-0009). След снасянето мишките се предозират с кетаминов коктейл (

1. Изчисляване на сумата AngII

Забележка: Този протокол се основава на примера на Infusion AngII (1000 ng/kg/min), хранени с обогатена с наситени мастни киселини диета в продължение на 4 седмици при 4 мъжки LDL рецепторни -/- мишки.

  1. Претеглете изследваните мишки, преди да изчислите количеството AngII, необходимо за инфузия.
  2. Използвайте шаблона (Таблица 1) за изчисляване на масата AngII, необходима за експеримента. Използвайте "Средна скорост на помпата" в инструкциите за употреба на помпите като "Скорост на помпата", показана в стъпка 4 на шаблона. В шаблона записвайте стъпки 1-5 ръчно и стъпки 6-10 се изчисляват автоматично.
    1. В заключение, че мишките ще получат 1 g телесно тегло по време на инфузията от 1000 ng AngII/kg/min в продължение на 4 седмици.
      ЗАБЕЛЕЖКА: Всяка мишка има много различни увеличения на телесното тегло, които зависят от много променливи, като щам на мишката и диета. Ние рутинно използваме "0" или "1 g" въз основа на собствения си опит от предишни проучвания.
    2. Изчислете 300 μl общ обем разтвор на AngII за всяка мишка, тъй като всяка помпа изисква приблизително 250 μl.

2. Разтварянето на AngII

  1. Съхранявайте лиофилизирани флакони AngII при -20 ° C. Равновесете флаконите AngII до стайна температура преди отваряне.
  2. Претеглете изчислената маса AngII (7,3 mg, както в Показана е таблица 1) в стерилна пластмасова тръба.
    ЗАБЕЛЕЖКА: Според индекса на Merck не използвайте стъклени епруветки за разтваряне, тъй като водният разтвор на AngII има силен афинитет за свързване със стъкло.
  3. Добавете изчисления обем стерилен физиологичен разтвор (1200 μl) към пластмасовата епруветка, съдържаща лиофилизирания AngII, капачка и разбъркайте чрез инверсия, докато разтворът стане бистър.
  4. Етикетирайте номера на мишките №1, №2, №3 и №4 на отделни стерилни пластмасови туби с капачки (0,5-1,5 ml). Пригответе разтвор на AngII под ламинарен абсорбатор за всяка мишка въз основа на телесното тегло, както в стъпка 1.2 и Таблица 1 изчислена.
    1. Например, пипетирайте 3,6 μl стерилен физиологичен разтвор в епруветка №1, след това 296,4 μl разтвор на AngII и разбъркайте, като пипетирате внимателно нагоре и надолу.
  5. Обозначете номера на мишката върху пластмасови туби с капачки (4 ml, стерилни). Те ще се използват за инкубиране на помпи, както е описано в стъпка 3.13.

3. осмотично пълнене на помпата

7. Образно изобразяване на аорти

  1. Разрежете аортата надлъжно през външната и вътрешната кривина на аортната дъга и отрежете отворени основни клони, включително безноминална, лява каротидна артерия и лява ключична артерия. Пин аорта плоска с външно адвентично полагане до черния восък.
  2. Придобийте изображение на лицевата страна на аортата на интимната повърхност със същото увеличение. Включете линийка във всяка снимка за калибриране, както се появява в четвъртата.

Представителни резултати

Описаните в протокола 4 мъжки LDL рецепторни// - мишки бяха евтаназирани след 4 седмици вливания на AngII. Аортите бяха събрани, почистени и изобразени, за да се визуализират дилатациите на аортата. Както в Фигура 3 показана, аортите имат различни свойства, включително разширяване на надбъбречната област (AAAs; 3А), разширението на зоната за катерене (TAAs; 3Б) или разширяване на двете области (наличие на двете AAA и TAA, Фиг 3C), докато морфологията при мишка беше приблизително нормална (3D). Разширението на коремната аорта се определя количествено чрез измерване на ex vivo максималната ширина на надбъбречната област, както е показано с червената линия в 3А е показано. За да се измери възходящата дилатация на аортата, аортите се разрязват и отбелязват, както в Фигура 4 показана. Интимна повърхност беше измерена с червени линии във възходящата аортна област (зона, заобиколена от th в 4А) за количествено определяне на TAA. Оттогава във всяка снимка е включена линийка за стандартизиране на измерванията в две фигури 3 и 4 показани.

ангиотензин
. Фигура 1. Представително изображение на напълнена осмотична помпа Всяка помпа съдържа две части: основно тяло и модератор на потока. След напълване на корпуса на помпата с AngII се въвежда модератор на потока, който запечатва помпата.

инфузия
Фигура 2. Процес на операция на имплантация на помпа (A) Мишката се поставя в ламинарна качулка с носен конус, който непрекъснато освобождава изофлуран и кислород Събрах. (Б) В разреза се вкарва прав хемостат, за да се образува подкожен тунел; (° С) Помпата е щадяща през поставения разрез на кожата; (Д) Разрезът на кожата се закрепва с помощта на телбод след поставянето на помпата.

помощта
Фигура 3 Аортни изображения (ex vivo) на мишки, инфузирани с AngII AngII 1000 ng/kg/min се влива при мъжки LDL рецептор -./- мишки 28 дни. (А) ААА, придружени от тромбоза; Червената линия (2.05 mm) показва измерването на максималната ширина на аортата в надбъбречната област. (Б) възходяща аортна дилатация (TAA) с приблизително нормална коремна аорта; (° С) Дълбоки дилатации както във възходящата, така и в надбъбречната аортна област (TAAs и AAA); (Д) грубо нормална аорта без видимо увеличение на възходящата или надбъбречната аортна област.

4.jpg "/>Фигура 4. Образи на лицето на гръдната аортна област от мишки, заразени с AngII AngII 1000 ng/kg/min се влива в мъжки LDL рецептори влива се. -/- мишки в продължение на 28 дни. Област, очертана с червена линия, представлява възходящата аортна област, включително част от аортната дъга.

1 Необходима доза 1000 ng/kg/min
2 Стартирайте телесното тегло (най-голямата мишка) 24.8 G
3 Очаквано общо наддаване на телесно тегло 1 G
4-ти Скорост на изпомпване 0,25 ул/час
5 Брой мишки 4-ти
6-то Доза на час за животното 1518 ng
7-ми Изисква се концентрация 6072 ng/ул
8-ми За 300 μl разтвор 1.82 mg/300 µ
НЕОБХОДИМО РЕШЕНИЕ
9 Общ AngII (mg) 7.3 mg
10 Разтворени във физиологичен разтвор и # 160; 1200 ул
мишка телесно тегло Коефициент на разреждане Обем (ul) Тегло на помпата (g) Запълнено съотношение
# (G) AngII Солено Празно Попълнено (%)
1 24.5 1.0 296.4 3.6 1.1443 1.3877 99
2 23,0 0.9 278.2 21.8 1.1677 1,4145 100
3 24.8 1.0 300,0 0,0 1.1438 1.3904 100
4-ти 21.8 0.9 263.7 36.3 1.1438 1.3904 100
Коефициент на разреждане = телесно тегло на мишката/най-голямото телесно тегло на мишката
мишка телесно тегло Коефициент на разреждане Обем (ul) Тегло на помпата (g) Запълнено съотношение
# (G) AngII Солено Празно Попълнено (%)
1 24.5 1.0 296.4 3.6 1.1443 1.3877 99
2 23,0 0.9 278.2 21.8 1.1677 1,4145 100
3 24.8 1.0 300,0 0,0 1.1438 1.3904 100
4-ти 21.8 0.9 263.7 36.3 1.1438 1.3904 100

Таблица 1: Изчисляване на 28-дневната инфузия чрез осмотични помпи.

Дискусия

Осмотичните помпи, доставящи AngII подкожно, са рутинен подход за индуциране на аортни аневризми при мишки. Въз основа на данни от много лаборатории непрекъснатите резултати показват, че това е надежден и възпроизводим метод за изследване на AAAs 3,4 и TAAs 22-26 при мишки. Следователно, този модел на мишката се използва като модел, който рекапитулира няколко функции на човешките аортни аневризми и предоставя механистични прозрения за тези опустошителни заболявания.

Въпреки че стареенето е рисков фактор за ААА при хората, то не е систематично изследвано за ААА, предизвикани от AngII при мишки. Оказва се обаче, че честотата и тежестта на индуцираните от AngII AAA са сходни при мишки на възраст 8-48 седмици 4,5,7. Понастоящем има само няколко проучвания върху AngII-индуцирани TAA при мишки на възраст от 8 до 24 седмици 22 до 26, които не показват очевидни възрастови разлики в образуването на TAA.

В обобщение, вливането на AngII се постига чрез подкожно имплантиране с осмотични помпи за индуциране на аортни аневризми при мишки. Този метод доставя AngII непрекъснато с определена скорост за определени периоди от време, които се използват за изследване както на AAA, така и на TAA.

Разкриване

Публикуването на тази статия е спонсорирано от Alzet.