От акушерската клиника
1 От Клиниката по акушерство към Медицинския факултет на Charité Universitätsmedizin Berlin ДИСЕРТАЦИЯ Th 1-цитокини и протромбиназа fgl2 при нормална и патологична бременност Предоставени в Медицинския факултет Charité на Университета Хумболт с цел придобиване на академична степен Doctor medicinae (Dr. med.) Берлин от Maike Knackstedt от Берлин
2 декани: проф. Д-р мед. J.-W. Дуденхаузен проф. Д-р мед. Matin Paul Рецензент: 1. Проф. Д-р мед. J.-W. Дуденхаузен 2. Проф. Д-р. мед. хабил. Х. Донат 3. Проф. Д-р мед. G. Schönfelder Дата на докторат: 24 септември 2004 г.
3 Съдържание 3 Съдържание Списък на съкращенията 5 Цели 6 1 Въведение Основи на имплантирането на ембрион Начало на бременността Моделът на трансплантация Патологична имплантация Имунологични основи на бременността Парадигмата Th 1/Th 2 Ролята на Th 1 цитокините при бременност Последици от имунологичния дисбаланс по време на бременност Активирането на коагулационната система Ролята на апоптозата при бременност Аспекти на спонтанния аборт Имунологични принципи на спонтанния аборт Два модела на аборт при мишки CBA/J: стрес срещу IL имунологични аспекти на прееклампсия Въпрос 21 2 Материал и методи Тестови животни Пациент колектив Експериментална настройка на експерименти с животни Процент на абортите в проценти Подготовка на тъкани Обща екстракция на РНК ДНКазна обработка на пробите от РНК Обратна транскрипция Качествена PCR Агарозна електрофореза Количествен PCR анализ на данните на Taq-Man Подготовка на плазмидна ДНК в малък мащаб (мини подготовка) линеаризация на плазмидния cDNA синтез на 35-маркирана РНК сонда in situ хибридизация имунохистохимия TUNEL оцветяване Giemsa оцветяване статистически анализ на данните 41
4 Съдържание 4 3 Резултати Увеличението на скоростта на абортите чрез стрес и чрез инжектиране на IL-12 p Влиянието на стреса върху експресията на mrna на абортогенни цитокини Увеличението на TNF-α mrna след излагане на стрес Експресията на IFN-γ след прилагане на стрес Die Влияние на mrna експресията на IL-12 от стрес Съотношението на скоростта на абортите към количественото количество цитокини Цитокиновият профил след инжектирането на IL Сравнението на експресията на fgl2 mrna при стрес и след инжектирането на IL Индукцията на апоптоза от стрес и IL -12 в модела на мишка Експресията на TNF-α през първия триместър и третия триместър Експресията на fgl2 mrna и fgl2 протеин в човешката плацентарна тъкан Първият триместър Третият триместър Апоптоза при прееклампсия и спонтанен аборт 59 4 Дискусия 61 5 Резюме 72 6 Списък на публикациите 74 7 Приложение 91
5 Списък на съкращенията 5 Списък на съкращенията// Увеличение/Намаляване/константа ASA Ацетилсалицилова киселина CD Клъстер на диференциация ДНК Дезоксирибонуклеинова киселина (A = киселина) COX Циклооксигеназа EGF Епидермален фактор на растеж fgl2 Фибриноген-подобен протеин HLA-Heno-Hen-Heno-Hen-Heno-Hen-Heno-Hen-Heno-Hen-Heno-Hen-Heno-Heno-Hen-Heno-Hen-Heno-Hen-Heno-Hen-Hen Трансфераза IDO индоламин-2,3-диоксигеназа IFN-γ интерферон-гама IL интерлевкин IRF интерферон-регулаторен фактор LIF левкемия-инхибиторен фактор LPS липополизахарид MHC главен-хистосъвместимост-комплекс MHV3 миши хепатит-вирус-MNA макрофафа макрофафа mrna (пратеник) рибонуклеинова киселина (A = киселина) NK клетки/uNK клетки Естествени клетки убийци/маточни NK клетки NO азотен оксид NOS (инос) азотен оксид синтаза (индуцируема азотна оксидна синтаза) OX орексин = CD 200 PAI инхибитор на плазминогенен активатор PCR полимеразна верижна реакция PE прееклампсия PMNL полиморфонуклеарни левкоцити RT обратна транскриптаза TGF трансформиращ растежен фактор Th T помощна клетка TNF-α туморен фактор на некроза-алфа VEGF съдов ендотелен фактор на растеж
6 Цели 6 Цели Целта на тази работа е да 1 в модела на мишката с комбинация от двойки CBA/J женски и DBA/2J мъже разликите в профила на маточния цитокин и ролята на протромбиназа фибриноген-подобен протеин 2 (fgl2 за кратко) при индуциран стрес и предизвикан от възпаление аборт. 2 за характеризиране на цитокиновия профил във връзка с възможно активиране на коагулационната система чрез fgl2 като протромбиназа в децидуална тъкан на пациенти с нормална бременност и на пациенти в първия триместър с аборт. 3 за описване на експресията на Th1 цитокини и на fgl2 в плацентарната тъкан от пациенти с неусложнен ход на бременността и пациенти с прееклампсия през третия триместър.
22 Въведение 22 Бременност Усложнения Изследват се спонтанен аборт и прееклампсия и връзката с имунологичен дисбаланс.
25 Материал и методи 25 Имплантационна резорбция Фигура 3: Представяне на един от страничните рога на матката с V-образна мишка Две имплантации () и две резорбции () са показани в мишката матка на 13,5 ден от бременността, следователно лежи в страничния рог на матката, показан по-горе аборт 50%. 2.5 Подготовка на тъканите За молекулярно-биологичните изследвания се приготвят 100 mg от маточната тъкан от местата на успешни имплантации и се измиват внимателно със стерилен PBS (pH = 7,4) и след това незабавно се замразяват с помощта на течен азот и се съхраняват при 80 ° С, докато РНК се изолира. Не са взети тъканни проби от страна на абсорбцията, тъй като тъканта вече се е разложила хеморагично и некротично и пробните тестове показват, че тази тъкан е неподходяща за диагностика на цитокини. 2.6 Материал за обща екстракция на РНК: тризол хлороформ етанол (100%, 75%) агарозен гел 1,5% етидуим бромид (10 mg/ml) центрофуга за деспергиране (5415C) Gibco BRL, Karlsruhe, D Merck, Darmstadt, D Merck, Darmstadt, D Biozym, Oldendorf, D Gibco BRL, Karlsruhe, DT 8.10, IKA Labortechnik Eppendorf, Хамбург, D
31 Материал и методи 31 (хипоксантин фосфорибозил трансфераза), получени като референтен ген. Всички сонди бяха проверени за тяхната специфичност за cdna, т.е. геномната ДНК не беше амплифицирана. Последователности на праймера: Миши HPRT: Пример 7,8: 5 -gttggatacaggccagactttgt Реверс: 5 -CACAggACTAgAACACCTgC Мурини IFN-γ: Напред: 5 -CagCAACAACATAAgCgTCAT Реверс: 5 -CTCCTTTTCCgCTTCCTgAg Миши fgl2: Напред: 5 -CAACAgTTTggATggCAAgTg Реверс: 5 -CTTTgTATATTAgATgAACCgg Миши IL-12 p40: Напред: 5 -TTCAgTgTCCTgCCAggAgg Назад: 5 -CgggTCTCCGGTTTGATgATg HPRT: 5-6FAM-TTgCAgATTCAACTTgCgCTCA XT CTT p PCR температура: 60 C или 63 C Миши IFN-γ: 5-6FAM-TTCCggCAACAgCTggTggACCAC XT p PCR температура: 60 C Миши TNF-α: 5-6FAM-gTAgACAAggT PCR температура: 63 C Миши fgl2: 5-6FAM-gTgTCCCAgCCAAgAACACA XT gca p PCR температура: 63 C
41 Материал и методи Статистически анализ на данните За полуколичествената оценка на имунохистохимията е използвана редовна скала с оценки +/++/+++. За статистическия анализ на тези данни U-тестът на Mann-Whitney беше използван като непараметричен тест за независими проби. Данните са показани графично в графични полета. PCR в реално време се оценява, както е описано по-горе. След приблизителен тест за нормално разпределение, данните бяха оценени с тест на Student Student T и представени в стълбовидни графики със стандартно отклонение.
47 Резултати 47 По същия начин IL-12 p40 (r = 0,24) и IL-12 p35 (r = -0,29) не показват никаква връзка с дела на резорбциите (Фигура 11 и Фигура 12)% от абортите r = IL-12 p40mrna Фигура 11: Корелация между процента на абортите и количеството IL-12, изразено p40 mrna Няма връзка между количеството IL-12 p40 и процента на резорбции% от абортите r = IL-12 p35 mrna Фигура 12: Връзка между процента на абортите в проценти и количеството на експресирания IL-12 p35 mrna Няма връзка между количеството IL-12 p35 и процента на резорбции.
48 Резултати Цитокиновият профил след инжектирането на IL-12 Въпросът е дали IL-12, като активен Т-клетъчен цитокин, може да индуцира Th 1 имунен отговор в мишката, което след това води до увеличаване на скоростта на абортите. След инжектирането на IL-12, измерванията показват 9,5-кратно увеличение на IFN-y mrna (Фигура 13). Интересното е, че инжектираният рекомбинантен IL-12 също оказва влияние върху експресията на TNF-a: След инжектирането експресията на TNF-α mrna се увеличава с 8,8 пъти (Фигура 13). След стимулацията от IL-12 следователно имаше съпоставено съзвездие на цитокини с едновременно присъствие на големи количества TNF-α и IFN-γ, както при едновременното инжектиране на двата цитокина: 10 8 пъти mrna n = 5 n = 7 n = 7 контрол, без инжекция IFN-γ mrna след инжектиране на IL-12 TNF-α mrna след инжектиране на IL-12 Фигура 13: Регулация на цитокини след инжектиране на IL-12 p70 Значително увеличение на TNF-α и IFN-γ след Инжектиране на рекомбинантен IL-12 p Сравнението на експресията на fgl2 mrna при стрес и след инжектиране на IL-12. Хибридизацията in situ показва хистологично локализацията на fgl2 mrna в матката на CBA/J мишки на 13.5 ден от Бременност (Фигура 14).
50 Резултати 50 Установено е обаче, че количеството TNF-α mrna е отрицателно свързано с количеството fgl2 mrna (Фигура 16). Няма статистически ясна връзка между fgl2 mrna и IFN-y mrna (Фигура 17). 9,5 9,0 TNF-α mrna 8,5 8,0 7,5 7,0 r = Fgl2 mrna 6 8 Фигура 16: Връзка между количеството TNF-α и количеството fgl2 mrna Не показва никакви значими Корелация между количеството TNF-α и количеството fgl2 mrna, отрицателна връзка между двата параметъра може да се разглежда като тенденция. 14 IFN- γ mrna r = 0, Fgl2 mrna 6 8 Фигура 17: Връзка между количеството IFN-γ mrna и изразеното количество fgl2 mrna Няма връзка между количеството IFN-γ и количеството fgl2 mrna.
53 Резултати 53 A B Фигура 20: Имунохистохимия за TNF-α в плацентата от 3-ти триместър с нормална бременност (A) показва IgG контрола и (B) показва оцветяването за TNF-α протеин. A B Трофобластен съд Фигура 21: Имунохистохимия за TNF-α в плацентата от 3 триместър на пациенти с прееклампсия (A) показва контрола IgG и (B) показва оцветяването за TNF-α протеин. Таблица 1 показва специфичния анализ на TNF-α белтъчно-положителните клетки при прееклампсия: Тъканни произход Ендотел Трофобласт Плацентарни макрофаги PE (n = 10) +/++ + +/++ Контрол (n = 12) + +/- +/++ Таблица 1: Имунохистохимия за TNF-α в плацентата 3-ти триместър при нормална бременност и при пациенти с прееклампсия Повишена експресия на TNF-α протеин в ендотелни клетки и трофобласти при прееклампсия (PE) в сравнение с нормалната бременност. Няма разлика в експресията на TNF-α протеин в трофобластни клетки и плацентарни макрофаги.
54 Резултати Експресия на fgl2 mrna и fgl2 протеин в човешка плацентарна тъкан Първият триместър Фигура 22 показва данните, получени чрез in situ хибридизация. A B Фигура 22: In situ хибридизация за fgl2 mrna 1-ви триместър вилус (A) показва сензорен контрол и (B) показва антисенсово оцветяване за fgl2 mrna. Показани са плацентарните власинки с двуклетъчния трофобластен слой, състоящ се от синцитиотрофобластите и цитотрофобластите, които са характерни за първия триместър. In situ хибридизация се извършва с помощта на 35 S-маркирана fgl2 mrna сонда. И в двете показани вили има типична черна маркировка на трофобластния слой в антисенс пробата, като пробата mrna е огледален образ на последователността fgl2 mrna. В отрицателната контрола, сензорната проба, в която пробата е идентична на fgl2-mrna последователността, няма положителен сигнал. Трофобластът също показва положителни сигнали (кафяв) за fgl2 протеин в имунохистохимията (Фигура 21).
55 Резултати 55 A B Фигура 23: Имунохистохимия за fgl2 в плацентата от първи триместър с нормална бременност (A) показва контрола IgG и (B) показва оцветяването за fgl2 протеин и представителен участък на съда. Тези резултати доказват за първи път, че fgl2 mrna и fgl2 протеин се експресират в човешки трофобластни клетки, особено ако е настъпил спонтанен аборт. Броят на fgl2-положителните съдове в общия брой съдове се увеличава, ако е настъпил спонтанен аборт (Фигура 24). Fgl2 положителни съдове/общ брой съдове 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 n = 6 * n =% медиана 25% контролен спонтанен аборт Фигура 24: експресия на fgl2 протеин в ендотелни клетки на Съдове през първия триместър Полуколичествен анализ на имунохистохимията за fgl2 на съдовете в decidua basalis на контрола и спонтанния аборт.
56 Резултати 56 Полуколичествената оценка на fgl2 експресията на зотичните трофобласти показва, че пациентите с аборт имат по-висока експресия fgl2 от пациентите с избирателно прекъсване на бременността (Фигура 25). Интензивност на оцветяване на fgl2 положителните зотични трофобласти 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 n = 6 * n = 9 75% медиана 25% контролен спонтанен аборт Фигура 25: експресия на fgl2 протеин в трофобласти от първия триместър Полуколичествен анализ на имунохистохимията за fgl2 върху трофобластните клетки на decidua basalis при контрол и спонтанен аборт AB корабни трофобласти (В) показва оцветяването за fgl2 протеин и представителен участък от съда.
58 Резултати 58 Следващата Фигура 28 показва зрели власинки на плацентата през третия триместър с нормален ход на бременността. Трофобластните клетки понякога експресират fgl2 протеин (Фигура 26 В). Фигура 29 показва плацентата на пациент с прееклампсия, като трофобластите експресират fgl2 протеин по-хомогенно. A B съдове Фигура 28: Имунохистохимия за fgl2 в плацентата от 3 триместър с нормална бременност (A) показва контрола IgG и (B) показва оцветяването за fgl2 протеин. A B Фигура 29: Имунохистохимия за fgl2 в плацентата от 3 триместър на пациенти с прееклампсия (A) показва контрола IgG и (B) показва оцветяването за fgl2 протеин. В съответствие с това наблюдение, впечатляващи отлагания на фибрин могат да се наблюдават в проби от плацента от пациенти с прееклампсия в сравнение с проби от плацента при неусложнена бременност.
59 Резултати Апоптоза при прееклампсия и спонтанен аборт Th 1 цитокините, особено TNF-α, са в състояние да предизвикат програмирана клетъчна смърт под формата на апоптоза. Изследването на апоптотичните сигнали през първия триместър и през третия триместър показа, че се наблюдава значително по-висока честота на апоптоза както в децидуята, така и в плацентите на прееклампсия (Фигура 30). A TUNEL + клетки на зрително поле 2,5 * 2,0 1,5 n = 5 1,0 0,5 5 n = 6 B TUNEL + клетки на зрително поле * n = n =% медиана 25% 4 контрол спонтанен аборт контрол прееклампсия Фигура 30: Апоптоза през първия и третия триместър А: Полуколичествен анализ на апоптотичните сигнали при спонтанен аборт. Б: Полуколичествен анализ на апоптотичните сигнали при прееклампсия.
60 Резултати 60 Фигура 31 показва апоптоза в плацентата през третия триместър. Фигура 31: Апоптоза през третия триместър Клетъчните ядра са оцветени в синьо, като апоптотичните фрагменти са флуоресциращи в зелено.