Науки за живота и Земята - Как да заглушим ген
Как да заглушите ген. РНК интерференция
Едно от най-новите открития в молекулярната биология е, че РНК могат да регулират генната експресия. В продължение на години им бяха възложени две основни функции:
- Messenger РНК (mRNAs) са основни едноверижни (едноверижни) междинни продукти между ДНК, която носи генетична информация, и протеини, които изразяват тази информация.
- Рибозомните (рРНК) и трансферните (тРНК) РНК от своя страна имат роля на "декодери" и катализатори на този протеинов синтез, поради тяхната структура. (вижте общата диаграма)
Тази картина се усложни малко, когато учените откриха RNAi (РНК интерференция) или как генната експресия се блокира от двуверижна (двуверижна) РНК молекула. Оттогава RNAi се превърна в революционен експериментален инструмент за разбиране на ролята на гените. Бивш защитен механизъм на генома, той участва в блокирането на транскрипцията (синтеза на иРНК от ДНК) и този на транслацията („четенето“ на иРНК в пептид).
Откритие
Механизмът на RNAi се основава на прост технически принцип: чрез инжектиране на множество копия на двуверижна РНК (двойна верига или dsRNA) в червея Cænorhabditis elegans ние блокираме функционирането на гена, чиято последователност допълва тази dsRNA. Подобно на много големи открития, това на RNAi се основава на неочакван експериментален резултат.
В края на 80-те и началото на 90-те години, физиолозите на растенията, работещи върху петунията, бяха изненадани, когато откриха, че въвеждането на множество копия на ген, кодиращ цвета тъмно лилав, далеч от подобряването на цвета на цветята, е причинило появата на бели петна по венчелистчетата. По все още неизвестен начин въведените гени (трансгените) не само бяха замълчали, но и блокираха собствените гени на растението гостоприемник. Същият резултат се получава, когато растенията са заразени с вирус, генетично модифициран, за да съдържат само фрагменти от гена.
Тези резултати не бяха разбрани до публикуването на работата на Fire и Mello през 1998 г .: РНК вирусите умножават своя генетичен материал чрез намесата на dsRNAs и многобройните копия на трансгени също причиняват образуването на dsRNA. Следователно явлението RNAi е древен клетъчен защитен механизъм, който се появява много преди разминаването от червеи към растения, който блокира всяка възможност за анархично размножаване на "девиантния" генетичен материал или от вирусен произход, който обикновено липсва в клетката.
Как работи ?
Едно от първите наблюдения, което е помогнало да се разбере механизмът на RNAi е, че растенията, чиито гени са заглушени, произвеждат малки РНК от 20 до 25 нуклеотида, допълващи блокираните гени. Тези РНК, по-малки от иРНК и рибозомни РНК, отдавна остават неоткриваеми.
RNAi се възстановява in vitro от клетъчни екстракти от дрозофила. Първо, дългите dsRNAs са фрагментирани в по-малки RNAs със специфична структура: две вериги от 21 нуклеотида, от които 19 са двуверижни и 2 нуклеотида са несдвоени в краищата. Тези малки фрагменти са наречени "кратко интерферираща РНК" или siRNA; дори изкуствено синтезирани, те са в състояние да заглушат гените. Ензимът, който реже dsRNAs в siRNA, се нарича DICER. Това е ендонуклеаза от семейство РНКази III, специфично за dsRNAs.
След това получените РНК фрагменти образуват комплекс с протеини, наречени RISC.Тук нишките на "сетивните" siRNAs, подобни на тези на целевия ген, се отстраняват, оставяйки "антисенс" веригите, които се допълват. Те насочват протеинов комплекс към иРНК, произведена от гена, което води до унищожаването му. По този начин генът се транскрибира, но не се транслира, оттук и привидното му мълчание.
Това обяснява неуспеха на експериментите за трансгенеза при петунии. И двете вериги на трансгена могат да бъдат транскрибирани (вместо единична верига като нормален ген), произвеждайки dsRNA вместо mRNA. След това се нарязва на няколко siRNA, които блокират гена, който ни интересува. Колкото повече копия на гена, толкова повече клетката го "заглушава" !
RNAi не работи по този начин за всички организми. Например, РНК-зависима РНК полимераза може да се намеси: тя използва антисмислената верига на siRNA като праймер за синтезиране на повече dsRNA, усилвайки механизма. При растенията това явление се разпространява чрез нерепродуктивни (соматични) тъкани, чрез прехвърляне на dsRNA от клетка в клетка, генерирайки удължаване на устойчивостта към вирусни инфекции. Такъв механизъм е малко вероятен при дрозофила или гръбначни животни, тъй като въпросната полимераза не е открита в тях.
Какъв е смисълът ?
Малките интерфериращи РНК или siRNAs могат да имат роля в борбата с транспонируеми елементи, повтарящи се гени (включително трансгени) и вируси.
Транспозоните, онези палави "скачащи гени", които имат злощастния навик да паразитират ДНК, като се дублират, за да се поберат навсякъде, съставляват почти половината от генетичните последователности при хората. Заглушаването им е от решаващо значение за стабилността на генома! Червеите с мутирали гени, участващи в RNAi, не са в състояние да блокират определени транспозони в зародишните тъкани (източник на репродуктивни клетки). Същото е и за растенията.
Този механизъм може също така да контролира нивото на генна експресия в определени тъкани. Например при Drosophila количеството копия на трансген може да промени резултата: определен брой копия генерира силна експресия на гена, който ни интересува, но от пределна концентрация неговата експресия, напротив, се намалява. Включени са протеини, които „обвиват“ ДНК; тяхната структура е модифицирана, за да спре транскрипцията. При дрождите този процес, наблюдаван върху транспонируеми елементи, странно се простира до съседни региони.
RNAi: siRNA или miRNA . (вижте диаграмата)