Метод за пречистване без протеин за определяне на афинитет на свързване чрез микрофорезна термофореза

Обобщение

Микромащабната термофореза (MST) може да се използва широко за определяне на афинитета на свързване без пречистване на целевия протеин от клетъчни лизати. Протоколът включва свръхекспресия на GFP-кондензиран протеин, лизис на клетки при неденатуриращи условия и откриване на HNR сигнали в присъствието на различни концентрации на лиганда.

Резюме

Количествената характеристика на протеиновите взаимодействия е от съществено значение във почти всички области на науките за живота, особено при откриването на лекарства. Повечето налични понастоящем методи за определяне на K D изискват достъп до протеина, който представлява интерес, чието производство може да отнеме много време и да бъде скъпо за пречистване. Разработихме протокол, който позволява определяне на афинитета на свързване чрез микроскопска термофореза (MST) без пречистване на целевия протеин от клетъчни лизати. Методът включва свръхекспресия на GFP-кондензиран протеин и лизис на клетките при неденатуриращи условия. Прилагането на метода на STAT3-GFP, експресиран преходно в клетки HEK293, даде възможност за първи път да се определи афинитетът на добре изучения транскрипционен фактор за олигонуклеотиди с различни последователности. Протоколът е ясен и може да има различни приложения за изследване на протеиновите взаимодействия с малки молекули, пептиди, ДНК, РНК и протеини.

Въведение

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

1. Приготвяне на клетъчен лизат

Този протокол е предназначен за прилепнали клетки, експресиращи кондензиран GFP протеин. Броят на необходимите клетки може да варира от минимум 10 6 до по-малко от 20 х 106 клетки, в зависимост от нивото на експресия на протеин. Например, HEK клетъчен лизат свръхекспресиращ GFP-STAT3 се приготвя чрез третиране на клетки, отгледани в 10 T75 колби до близо 70% сливане с 1 ml лизисен буфер. Този лизат обаче трябва да се разрежда 150 пъти, за да се осигури оптимално ниво на флуоресценция за MST експеримента. Протоколът за клетъчен лизис силно зависи от свойствата и вътреклетъчната локализация на изследвания протеин. Ако използването на детергенти е нежелателно поради нестабилност на протеина, описаният по-долу ултразвук може да е най-добрият избор. Към лизисния буфер могат да се добавят различни добавки, за да се предотвратят реакции на модифициране на протеини: EDTA предотвратява фосфорилирането, натриевият ванадат инхибира тирозин протеиновите фосфатази, така че натриевият флуорид е инхибитор на Ser/Thr фосфатазите.

2. Избор и подготовка на MST буфер

  1. Тъй като взаимодействията между протеин и лиганд зависят от буферните условия, съставът на MST буфера се избира въз основа на свойствата на определена система. По принцип е полезно да се тестват поне два различни тампона.
  2. Пригответе 2 MST 5x буфера. Имахме добър опит с тези два състава: HEPES (250 mM HEPES, pH 7,4, 25 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 0,25% NP-40) и Tris HCl (250 mM Tris HCl, pH 7,4, 750 mM NaCl; 50 mM MgCl2, 0,05% Tween-20). Добавянето на BSA (5% в крайната свързваща смес) може да помогне за предотвратяване на адхезия на протеини към пластмасови тръби и стъклени капиляри. NaN3 (0,5 тМ) също може да се очаква да предотврати растежа на микроорганизми.

3. Определяне на оптималното разреждане на лизат

  1. Изберете източника на възбуждане на LED с дължина на вълната λ = 470 nm на MST инструмента.
  2. Заредете капилярите с ECll екстракт, разреден 2 и 10 пъти с MST буфер.
  3. Извършете операцията „Намиране на капиляри“ на софтуера MST Instrument Control. Оптималният диапазон на флуоресценция в разредения лизат е 400 до 1500 флуоресцентни единици.

4. Определяне на оптималния диапазон на концентрация на лиганд

  1. Най-високата концентрация на лиганд трябва да бъде поне 20 пъти по-голяма от очакваната константа на дисоциация.
  2. По-ниската концентрация на лиганд трябва да бъде по-ниска от моларната концентрация на флуоресцентен протеин.

Обърнете се към инструмента за търсене на NanoTemper Concentration Technologies за оценка на диапазона на концентрация на лиганд.

5. Приготвяне на клетъчен лизат и разреждания на лиганди

  1. Поставете решетка с необходимия брой (обикновено 10-16) от 0,5 ml епруветки за центрофугиране LoBind върху лед. Пипетирайте 25 µl MST буфер в дъното на всяка епруветка. Добавете 25 µl от основния разтвор на лиганда към първата вана (# 1, лиганд с по-висока концентрация) и последователно извършете разреждането на лиганда два пъти, като използвате останалите епруветки. Дръжте багажника с проби от лиганд върху лед.
  2. бавно размразявайте клетъчния лизат върху лед.
  3. Разредете клетъчния лизат с MST буфер, за да осигурите оптимално ниво на флуоресцентен целеви протеин в реакциите на свързване. Крайната концентрация на протеин трябва да бъде близо до прогнозираното K D или по-малко. Той трябва да се регулира, за да се получи необходимия брой на флуоресценция в крайния разтвор. За определяне на концентрацията на GFP-STAT3 в лизата инструментът е калибриран с помощта на флуоресцеин. Моларната концентрация на GFP в лизата се определя, като се използва съотношението на флуоресцеин и EGFP, съответно, квантови добиви, 0,85 и 0,61.