Метод за определяне на нивата на мазнини, базиран на плаваемост в протокол дрозофила (преведен на немски)

Обобщение

Тук представяме метод за измерване на нивата на мазнини в организма в третата ларва (L3) на ларвата на Drosophila melanogaster. Тази процедура използва сравнително ниската плътност на мастната тъкан, за да разграничи ларвите с променено съхранение на мазнини. Анализът на плаваемост е ценен инструмент за бърз, възпроизводим и икономичен скрининг.

Въведение

Процедурата възниква, както следва, като се използва разликата в плътността между мастната и постната тъкан. Мастната тъкан на бозайниците има плътност около 0,9 g/ml 14, докато скелетната мускулатура има плътност 1,06 g/ml 15. Тази разлика означава, че животните с по-високи запаси от мазнини имат по-ниска плътност от животните с по-ниски запаси от мазнини които им позволяват да плават в разтвор с по-добра плътност на твърдото вещество. Това свойство позволява изключително бърз скрининг на голям брой животни, като същевременно е евтин и неинвазивен. Анализът, базиран на плаваемост, се използва за потвърждаване както на фенотипите на променящите се известни регулатори на нивата на мазнините, така и за идентифициране на нови генетични и неврологични регулатори на затлъстяването 16,17.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

1. Съберете яйца от руно с генотипове, които представляват интерес

ЗАБЕЛЕЖКА: Идеалните кръстове се състоят от 150 девствени мухи и поне 75 мъжки. В колекциите трябва да има поне 200 мухи.

2. Прехвърлете ларвите в експериментални храни

  1. Пригответе експериментална храна.
    ЗАБЕЛЕЖКА: Тази рецепта за храна се основава на средния рецепт Bloomington Stock 18. Важните промени, както се преценява, включват увеличаване на количеството мая, за да се оптимизира хранителната стойност на храната чрез определяне на времето за ходене (между 112-120 часа след събиране на яйца при 25 ° C). Въпреки че сме намерили тази рецепта идеална за здравето и развитието на нашите експериментални ларви, рецепта за храна е приемлива при калибриране с положителни и отрицателни контроли, примери за които са изброени в стъпка 3.10.
    1. Измерете 1600 ml дестилирана вода.
    2. Смесете 134 g царевично брашно, 10,6 g агар Drosophila тип II и част от водата (

    500 ml) в чаша от 1 l. Бъркайте в продължение на 2 минути с моторизиран ръчен миксер. Смесете 70 g жива суха мая, 18,4 g соево брашно, 84,8 g малцов екстракт и част от водата (

    3. Определете нивата на мазнини в ларвите

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Представителни резултати

    илюстрация 1 показва пример за това как анализът, базиран на плаваемост, може да открие както по-високи, така и по-ниски запаси от мазнини в генетично модифицирани ларви. 1А показва, че стимулирането или заглушаването на определена подгрупа от неврони (E347) в мозъка на ларвата предизвиква по-ниски и по-високи мастни запаси. И в двата случая беше използван един и същ генетичен контрол. 1В показва пример за това как този фенотип, получен чрез анализа на плътността, се потвърждава чрез неутрална липидна екстракция и количествено определяне чрез GCMS.

    определяне
    илюстрация 1. Невронната функция в определени области на мозъка на ларвата е необходима и достатъчна за на телесни мазнини - регулиране. Невронната активност в посочената линия E347-GAL4 е заглушена от свръхекспресията на Shi DN или активирана чрез свръхекспресия на NB, както е посочено в панелите, и са оценени ефектите върху телесните мазнини. (А) Процент ларви плуват в равновесие в разтвори с различна плътност Бяха изследвани петдесет ларви на биологична репликация, n = 7 до 9 биологични повторения на генотип (Б) Процент телесни мазнини (напълно неутрални липиди, включително триацилглицериди и фосфолипиди, разделени на телесно тегло), измерени с GCMS 17.20 (n = 8). Сините линии или ленти представляват само GAL4 (без UAS) животни, пресечени w 1118 за ефекти от генетичния фон да контролирам. P-стойностите представляват резултатите от двустранни t-тестове. **** P 16 променен. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

    Дискусия

    Допълнителна полза от тази техника пред останалите е повишената чувствителност към малки промени в нивата на мазнини в популация. Чрез провеждане на цял градиент на концентрация в популация от 50 ларви, леки промени в стойностите на мазнините в популацията се идентифицират чрез промяна в средните концентрации, въпреки че концентрацията на ларвите започва да плава и е пълна, може да не се различава от контролите плавал. Тази малка промяна в популацията не винаги може да бъде идентифицирана чрез други методи за количествено определяне на мазнините, тъй като те изискват да се анализира голяма група ларви. Тестът за плътност от друга страна разпитва индивиди в популацията и следователно може да открие тези малки промени или промени в общото разпределение на популацията.

    Тъй като тази техника разчита на плътността на разтвора, за да даде надеждни резултати, изключително важно е разтворите на PBS и захарозата да се правят последователно. Установихме, че различните рецепти на PBS създават разлики в плътността на разтвора и водят до различни резултати. Ще използваме описаната по-горе рецепта за постоянни резултати. В допълнение, получаването на 20% захароза от същата партида 1x PBS е важно, тъй като води до същия фон на плътността на разтвора. Ако двата разтвора се приготвят поотделно, леки вариации в плътността в PBS могат да доведат до допълнителни променливи на плътността извън добавянето на захароза към експерименталния коничен флакон. И накрая, изпарението може да бъде проблем, тъй като с течение на времето, когато водата се изпарява, разтворите ще станат по-концентрирани. Ето защо е важно бутилките да се затварят плътно и да се преработва разтворът всяка седмица, така че експерименталните разтвори да останат последователни.

    Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.