Лептинът влияе върху обмяната на чревните епителни клетки в корелация с експресията на лептинов рецептор

• абстрактно
• Основна
• МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ
• Животни.
• Експериментален дизайн.
• Хирургична процедура.
• Параметри на корекция на червата.
• Хистологично изследване.
• Лазерна микродисекция и подготовка на РНК.
• RT-PCR.
• PCR в реално време.
• Пролиферация на криптни клетки и апоптоза на ентероцитите.
• Експресия на Bax и Bcl-2 гени.
• Статистически анализ.
• РЕЗУЛТАТИ
• Параметри на корекция на червата.
• Пролиферация на ентероцити и апоптоза в йеюнума.
• Дълга форма на експресия на LEPr и обмен на ентероцити в илеални крипти.
• Дълга форма на експресия на LEPr и апоптоза на ентероцитите при илеални ворси.
• Експресия на свързани с апоптозата гени.
• ДИСКУСИЯ
• Терминологичен речник

абстрактно

Обширни проучвания в различни експериментални модели на синдром на късото черво (SBS) показват, че апоптозата на ентероцитите играе решаваща роля в адаптацията на червата след резекция (1, 2). Въпреки необходимостта от чревна хиперплазия, митотичните стимули не могат да потиснат програмираната клетъчна смърт (3). Много изследователи описват повишената ентероцитна апоптоза като механизъм, който компенсира увеличената пролиферация на ентероцитите, за да постигне нова хомеостатична скорост по време на корекция на червата (4). Повишената апоптоза насърчава изхвърлянето на генетично отклонени стволови клетки и предотвратява развитието на тумори (3, 4).

Адаптацията на червата след чревна резекция води до повишена пролиферация на чревните епителни клетки, както и до повишена програмирана клетъчна смърт, което показва ускорен клетъчен обмен. Резултатът от тези действия помага да се преоформят структурите на криптите на криптите в по-продълговати и функционално по-активни единици. Регулирането на баланса между клетъчното производство и загубата на клетки чрез апоптоза след резекция на червата е сложно и точните фактори, които ръководят този процес на адаптация, остават неясни (11, 12). По-специално, не е ясно къде много от тези трофични фактори действат по оста крипта-вилус. Последните открития сочат, че различни растежни фактори като кератиноцитен растежен фактор (13) и епидермален растежен фактор (14) се изразяват по различен начин по оста крипта-вилус. Това предполага, че различни трофични фактори могат да действат на различни места по тази ос. Наскоро демонстрирахме, че TGF-алфа (TGF-α) симулира оборота на ентероцитите според експресията на рецептора на епидермалния растежен фактор по оста на вилус-криптата (15).

Затлъстелият генен протеинов продукт лептин (LEP) се екскретира от адипоцитите и действа предимно върху хипоталамуса, който регулира енергийните разходи, приема на храна и телесното тегло (16). Въпреки че червата не е класическа прицелна тъкан за LEP, обширни проучвания в различни експериментални модели показват, че LEP определя важни физиологични ефекти върху чревния растеж, клетъчното съзряване и диференциация (17, 18). В предишната си работа показахме, че LEP стимулира адаптацията на червата след масивна резекция на тънките черва при плъхове (19). Въпреки това, малко се знае за механизмите, които стоят зад този положителен ефект.

Целта на това проучване беше да се изследват ефектите на LEP върху обмена на ентероцитите (пролиферация и апоптоза) във връзка с експресията на LEP рецептор (LEPr) по оста на вилус-крипта след масивна резекция на тънките черва при плъхове.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Животни.

Институционалният комитет по грижи и употреба на животните към Медицинското училище в Рапапорт (Technion, Хайфа, Израел) одобри съоръженията и протоколите за животните. Мъжки възрастни плъхове Sprague-Dawley с тегло от 240 до 260 g са настанени в отделни клетки от неръждаема стомана при постоянна температура и влажност и се поддържа 12-часов цикъл светлина-тъмнина. Плъховете са гладували със свободен достъп до вода в продължение на 12 часа преди експеримента. Общата анестезия е започнала с кетамин (ip 90 mg/kg) и ксилазин (ip 15 mg/kg).

Експериментален дизайн.

40 плъха бяха разпределени на случаен принцип към една от трите групи: група А, фалшиви плъхове бяха подложени на чревна трансекция (фалшив, n = 14); Група В, SBS животни са подложени на резекция на червата (SBS, n = 13); и група С, плъховете на SBS-LEP са подложени на резекция на червата (SBS-LEP, n = 13) и са третирани с LEP при ip доза от 50 mg/kg от d 4 до d 14.

Хирургична процедура.

Плъховете са подложени на една от двете хирургични процедури: чревна трансекция, последвана от реанастомоза или 75% резекция на червата. С помощта на стерилни техники коремът се отваря с помощта на разрез по средната линия. При фалшиви плъхове средното тънко черво беше прекъснато и сглобено отново без резекция на червата. 75% резекция на тънки черва в средата, подобна на тази, описана по-рано, е извършена при SBS животни. Това се състоеше от резекция на червата между 5 cm дистално от лигамента на von Treitz и 10 cm проксимално от илеоцекалната клапа. Непрекъснатостта на червата се възстановява чрез анастомоза от край до край, използвайки 6-0 абсорбиращи се конци (Vicryl, Ethicon Corporation, USA). При всички операции коремната кухина беше затворена на два слоя с течащ шев 3/0 Vicryl (Ethicon Corporation, САЩ). На следоперативните плъхове се разрешава вода по избор и течна диета. Плъховете бяха умъртвени на 15-ия ден чрез ip инжекция на пентобарбитал (75 mg/kg).

Параметри на корекция на червата.

Тънките черва бяха бързо отстранени, изплакнати със студен изотоничен физиологичен разтвор и разделени на два сегмента: йеюнум, близо до анастомозата и терминален илеум. Червата бяха разделени на антимезентериалната граница, измити със студен физиологичен разтвор, изсушени и всеки сегмент беше претеглен. Лигавицата беше изстъргана от подлежащата тъкан с помощта на шпатула (Sigma Chemical Co., Израел). Лигавичните проби се хомогенизират с TRIzol реагент. ДНК и протеин са извлечени по метода на Хомчински (20) и са изразени като микрограми на сантиметър на червата на 100 грама телесно тегло.

Хистологично изследване.

Хистологичните разрези са направени от проксималната йеюнум, дисталната част на илеума и сравними места в контролните животни. Сегментите на тънките черва се фиксират в 10% формалин за 24 часа и се обработват в стандартни парафинови блокове. Пет микрона тъканни участъци бяха оцветени с хематоксилин и еозин. Височината на вилите и дълбочината на криптата са измерени с помощта на софтуера за анализ на изображения Image Pro Plus 4 (Media Cybernetics, Балтимор, MD). Измерват се десет люспи и крипти във всяка секция и средното отчитане се записва в микрометри.

Лазерна микродисекция и подготовка на РНК.

Секции с дебелина 15 микрометра бяха монтирани върху специални предметни стъкла, покрити с мембрана без RNase и обработени с ултравиолетови лъчи (PALM Technologies, Bernried, Германия) и незабавно фиксирани в ледено студен 70% етанол за 2 минути. След инкубация в продължение на 60 s в 1% крезил виолетов ацетат, срезовете се дехидратират в етанолова серия (70 и 100% върху лед) и се оставят за кратко да изсъхнат на въздух. Слайдовете се съхраняват при -80 ° С до микродисекция. Секциите бяха изрязани с лазер в рамките на 3 дни. Слайдовете бяха наблюдавани с помощта на обърнат микрограф Zeiss Axiovert 200 M за улавяне и визуализирани на монитор с помощта на софтуера PALM Robo. Върховете на вили, страничните вили и криптите бяха разделени с помощта на лазера. РНК се екстрахира с помощта на RNeasy Microkit (Qiagen) и протокола за микродисекция. Всички проби се съхраняват при -80 ° C за дългосрочно съхранение.

RT-PCR.

Качеството на РНК се оценява с автоматизираната система за електрофореза Experion (BioRad). Пет микрограма РНК бяха обърнати в кДНК при 37 ° С, използвайки 200 цМ дезоксинуклеотиди (Sigma Chemical Co., Сейнт Луис, Мисури), 5 цМ случайни хексамери (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 20 U RNAguard (Amersham Pharmacia Biotech) транскрибиран) и 200 U/μl обратна транскриптаза на вируса на левкемия на мишка Молони (US Biochemicals, Cleveland, OH). Настройките на термоциклера са оптимизирани, за да се гарантира, че продуктите са във фаза на линейно производство.

PCR в реално време.

Експресията на дългата форма на нивата на LEPr се определя чрез количествена PCR в реално време върху пробите на cDNA, като се използва комплект за анализ TaqMan при поискване (ABsolute Blue QPCR ROX Mix (ROX багрило) от ABgene, Epsom, UK) ABI-PRISM 7000 (Приложни биосистеми, Фостър Сити, Калифорния). Грундове с единичен екзон (от PrimerDesing Ltd, Великобритания) на разстояние 3'UTR-1064 bp (смислов грунд, GCAGGGCTGTATGTCATTGTA; антисмислен грунд, GAACATGGTCCCAAAACAACTT) са разработени за производство на ампликон със 109 bp. 18S (5'AGGAATTGACGGAAGGGCC, 3'GTGCAGCCCCGGACATCTAAG) беше използван за достъп до един и същ cDNA товар за всяко отделение. Праймерите са специфични за дългата форма на LEPr и не са в един и същ екзон; В противен случай усилването на замърсяваща ДНК не може да бъде разграничено от усилването на cDNA.

Пролиферация на криптни клетки и апоптоза на ентероцитите.

Плъховете се инжектират със стандартен 5-бромодеоксиуридин (5-BrdU) реагент за маркиране (Zymed Lab, Inc, CA) в доза от 1 ml на 100 g телесно тегло 2 часа преди умъртвяването. Тканевите срезове (5 µm) се обезпаразитяват с ксилол, рехидратират се със степенуван алкохол и се оцветяват с биотинилирана анти-BrdU система с моноклонални антитела, като се използва комплект за оцветяване на BrdU (Zymed Lab, Inc, CA). Индексът на пролиферация се определя като съотношение на криптни клетки, които са оцветени положителни за BrdU на 10 крипти.

Допълнителни 5? Срезите бяха с дебелина m, за да се определи степента на апоптоза на ентероцитите. Имунохистохимия за каспаза-3 (усвоено с каспаза-3 концентрирано поликлонално антитяло; разреждане 1: 100; Biocare Medical, Walnut Creek, CA) се извършва за изолиране на апоптотични клетки, използвайки комбинация от стрептовидин-биотин-пероксидазен метод съгласно протоколите на Идентифицирайте производителя. Експресията на апоптоза на епителните клетки се изразява като общия брой апоптотични клетки по тази ос на 10 вили и 100 крипти. В някои случаи е извършен по-подробен анализ на местоположението на апоптозата, като се използват предварително установени техники (21). За тази цел апоптозата по протежение на вили се диференцира между долната трета на вилите (странични вили) и горната трета на вилите (върховете на вили). Апоптозата е записана като броя на апоптотичните клетки на 10 люспи. Квалифициран патолог, сляп за източника на чревната тъкан, извърши всички измервания.

Експресия на Bax и Bcl-2 гени.

Обща РНК беше изолирана от замразени проби на лигавицата (проксимална йеюнум и дистална илеум), използвайки реагент TRIzol (GIBCO BRL, САЩ), както е описано от Chomczynski (20). Част от общата РНК (2 µg в общ обем 25 µl) беше обърната с помощта на кит за синтезиране на cDNA от първата верига на миша левкемия на Moloney (MMLV) (Gene Choice, Inc. Frederick, MD) преписан. След PCR, амплифицираният продукт (5 ul) се пуска върху 2% агарозен гел, оцветен с етидиев бромид и се снима. Нивото на експресия на гена Bax и Bcl-2 се изразява като съотношение на сивата плътност на целевия ген към сивата плътност 18S в денситометрията. Последователностите за специфичните гени бяха, както следва: Bax 5 'ATGGACGGGTCCGGGGAGCA, 3'ATGGACGGGTCCGGGGAGCA, Bcl-2 5'TGAGGCCCTGTCTGCTTCTG, 3'AGGCTCCCGGGGCAGTCATGA (всички праймери Dags от AIG на Sigma. повечето mRNAs се експресират, 18S rRNA праймерите се разреждат 1:10, за да се приведат RT-PCR продуктите в същия експоненциален амплификационен обхват.

Статистически анализ.

Данните са изразени като средната стойност ± SEM. Еднопосочен ANOVA тест, последван от Bonferroni post hoc тест, беше използван за статистически анализ с р-стойност

Връзка между експресията на mRNA на рецептора на лептин (B) и пролиферацията на ентероцити (A) и апоптозата (C) в крипти след масивна резекция на тънките черва и лечение с лептин. Стойностите са средни ± SEM. Увеличение 1: 100. * стр

Ефект на резекция на червата и лечение с лептин върху ентероцитната апоптоза (В) в корелация с експресията на лептинов рецептор (А) в върховете на ворсинките и в страничните вили. Стойностите са средни ± SEM. Увеличение 1: 100. * стр

Ефект на резекция на червата и лечение с лептин върху експресията на Bax и Bcl-2 в образци на лигавицата на илеума. Стойностите са средни ± SEM. * стр. Морфологичните промени включват удължаване на ворсинките и задълбочаване на криптите, повишена пролиферация на ентероцити и увеличена миграция на ентероцитите по вилите. Функционалната адаптация води до повишено усвояване на хранителни вещества от изолирани ентероцити (21–23).

Основният недостатък на изследването е, че се анализират само нивата на иРНК в дългата форма на LEPr. Необходими са допълнителни експерименти, за да се оцени експресията на другите форми на LEPr, за които е известно, че съществуват в различни тъкани на плъхове.

В заключение, лечението с LEP стимулира чревния растеж при плъхови модели на SBS. Увеличената експресия на LEPr иРНК по оста на вилус-крипта може да покаже значима роля на LEP в модулацията на ентероцитната апоптоза в стомашно-чревната лигавица. Ефектът на LEP върху оборота на ентероцитите корелира силно с дългата форма на експресия на LEPr по оста на вили-криптата.

---