Laborjournal онлайн Journalclub - бактерии по грешен път
Сигрид Марч
Illustr.: IStock/Наталия Яцкова; редактиран от JM
(12.10.2020) ЛЕЙПЦИГ: Хората със затлъстяване понякога страдат от метаболитни нарушения и диабет тип 2. Изследователите са показали, че при тези пациенти повече бактерии от червата попадат в околната мастна тъкан и предизвикват там възпалителни реакции: колкото повече бактерии откриват, толкова по-високи са стойностите на възпалението и по-болните пациенти.
Повече от половината възрастни в Германия са с наднормено тегло, така че те имат индекс на телесна маса (ИТМ) над 25 kg/m 2; около 16 процента са с наднормено тегло (затлъстяване; ИТМ над 30 kg/m 2). Затлъстяването влияе върху вашето здраве, в зависимост от това къде се натрупват мазнините. По-специално, така наречената висцерална мазнина, която обгражда вътрешните органи в корема и ги предпазва от механични влияния, има тенденция да се разширява, когато има прекомерно количество храна. Въпреки това, тази висцерална мазнина не просто лежи наоколо; тя също така отделя различни хормони и адипокини. Те включват например цитокини като интерлевкин-6 (IL-6) и фактор на туморна некроза (TNF) -α или пептидния хормон адипонектин, инсулинов модулатор. Разбираемо е, че твърде много висцерални мазнини могат да изведат човешкия метаболизъм от равновесие.
Висцералното затлъстяване е добре известен рисков фактор за множество заболявания, например артериосклероза, рак или диабет тип 2. Около седем милиона души в Германия живеят със захарен диабет. Повече от 95 процента от болните показват тип 2, инсулинова резистентност, която често пълзи в напреднала възраст. Първоначално панкреасът продължава да произвежда достатъчно инсулин - за разлика от диабет тип 1 - но той вече не се абсорбира от целевия орган. Това води до трайно високо ниво на кръвната захар, което от своя страна насърчава увреждане на органи и усложнения като инсулт и инфаркт. Най-важните рискови фактори за диабет тип 2 в допълнение към генетичната предразположеност и твърде малкото упражнения са наднорменото тегло. 90 процента от пациентите са с наднормено тегло, една четвърт дори със затлъстяване.
Но защо някои затлъстели хора се разболяват много метаболитно, а други не? Това е въпросът, зададен от изследователите в клиниката и поликлиниката по ендокринология, нефрология и ревматология в Университетската болница в Лайпциг, по-точно директорът на изследването Петер Ковач. Той е професор по затлъстяване и генетика на диабета в Интегрирания център за изследвания и лечение на заболявания на затлъстяването. След като учи фармация в Словакия, Ковач идва в Грайфсвалд, където през 1998 г. получава докторска степен по генетика на диабет тип 2. След постдокторски години в Националния здравен институт във Финикс (Аризона), той се озовава в Лайпциг. Там той се срещна с лекарката Рима Чакарун. Ендокринологът работи върху адипокини по време на докторската си дисертация и по-късно инициира проучване за ефекта на чревния микробиом върху затлъстяването и метаболитните заболявания.
Това звучи като оптимална комбинация за разглеждане на връзката между затлъстяването и диабета тип 2. Изследователите установиха за особено озадачаващо, че възпалителни процеси се наблюдават в мастната тъкан на много затлъстели хора. „Като част от диета с високо съдържание на мазнини, други изследователи са хранели мишки с храна, съдържаща маркирани с флуоресценция бактерии. По-късно те откриха фрагменти от тези бактерии в мастната тъкан ”, съобщава Chakaroun. Дали бактериите бяха причината за възпалението? „Така започнахме да търсим бактерии в човешката мастна тъкан“, казва Ковач. Резултатът е публикация в Gut, като Chakaroun и (тогава все още) докторант Лукас Масие са първите автори (69: 1796-806).
За проучването изследователите от Лайпциг набраха 75 пациенти (среден ИТМ 48 kg/m 2), претърпели бариатрична хирургия. Стомашната байпас операция Roux-en-Y е вид намаляване на стомаха и скъсяване на тънките черва. Така храната преминава през обходната магистрала през храносмилателния тракт. Това трябва да помогне на хората да намалят теглото си, освен всичко друго, защото храната не се усвоява напълно. 33 от изследваните лица също са пациенти с диабет тип 2 със значително повишени параметри на възпаление и анормални стойности на метаболизма на глюкозата в кръвта.
По време на процедурата хирурзите взеха проби от подкожна и висцерална мазнина - възможно най-стерилни - от различни места, като оментума (мрежова структура на перитонеума) или мезентерията (част от суспензията на червата). От тези тъканни проби, Massier, Chakaroun и колеги изолират ДНК и РНК и произвеждат тъканни секции.
Всъщност изследователите откриха бактериална ДНК в мастната тъкан, макар и в изключително малко количество. Само 0,1 до 0,5 пикограма на микрограм обща ДНК не идват от хора, а от бактерии. По време на секвенирането на бактериалния ген 16S rRNA в тъканните проби те след това откриха голям брой следи. Някои могат да бъдат изключени като замърсяване с помощта на биоинформативни алгоритми, но пациентите със и без диабет се различават при 18 бактериални вида. Изследователите наричат това явление специфичен за тъканите таксономичен бактериален подпис, който също корелира с появата на възпалителни маркери и метаболитни параметри.
Питър Ковач, Рима Чакарун и Лукас Масие са разгадали загадката защо мастната тъкан на много затлъстели хора е възпалена. Снимка: Universitätsmedizin Laipzig (вляво); Частно (в средата и вдясно)
И двете групи пациенти са имали бактерии от щамовете Proteobacteria и Firmicutes в мастната тъкан и системно. Известно е, че по-специално бактериите на филумните фабрикути се срещат по-често от средното в чревния микробиом на затлъстели хора. „Знаем, че някои бактерии в чревния микробиом насърчават увеличаването на теглото и че съставът на микробиома зависи както от гените, така и от начина ни на живот“, казва Чакароун. Ето защо изследователите не бяха изненадани да открият тези щамове бактерии. Резултатите не могат да отговорят дали микробите действително мигрират през чревната стена в околната тъкан или се абсорбират пасивно - като клетъчни отломки, така да се каже.
Ето защо изследователите от Лайпциг не бяха достатъчни да търсят човешка мастна тъкан за фрагменти от бактериална ДНК. Те искаха да покажат, че всъщност има непокътнати бактерии в корема извън червата. За да направят това, те прибягнаха до метод, който всъщност се използва при анализ на околната среда. „CARD-FISH е значително по-чувствителен от FISH сам и се надявахме да успеем да открием малки количества бактерии в мастната тъкан“, казва Kovacs, а Chakaroun добавя: „Тъй като не сме експерти по микробите, провеждаме тези тестове заедно направено с Никулина Мусат от Центъра за екологични изследвания (UFZ) тук в Лайпциг. "
Какво е CARD-FISH? Познаваме FISH като флуоресценция in situ хибридизация, т.е. метод на хибридизация, при който маркирани с флуоресценция нуклеотидни сонди се използват за риболов на допълнителна ДНК или РНК на тъканни участъци, например. В много проби от околната среда има не само малки клъстери бактерии, те също са добре разпределени във всякакво количество мръсотия. Това означава, че фоновите сигнали често са значително по-големи от действителния флуоресцентен сигнал от сондата. За да се заобиколи това, към FISH вече се присъединява CARD, Catalysed Reporter Deposition: класическа тъканна секция за имунохистохимия се хибридизира с едноверижна ДНК сонда срещу еубактерии. Тази сонда не носи флуорофор, а ензима HRP (Хрянова пероксидаза). В присъствието на водороден пероксид, пероксидазата превръща неактивните, маркирани с флуоресценция тирамиди в тирамидни радикали. Те от своя страна се свързват ковалентно с ароматни странични вериги - например тирозин - на протеините в непосредствена близост до HRP. Тъй като този процес е ензимен, много тирамиди се „радикализират“ с течение на времето.
Вместо един флуорофор на сонда, изследователят получава до 1000 флуоресцентни сигнала с усилване на сигнала от Tyramid (TSA). По този начин дори най-малките следи от бактериален материал привличат погледа. С CARD-FISH бактериите могат да бъдат открити и количествено определени, без да се налага да ги премахвате или обогатявате предварително. И точно това постигнаха изследователите от Лайпциг - те откриха непокътнати бактерии в човешката мастна тъкан. Те също така показаха, че колкото повече бактерии в мастната тъкан, толкова по-високи са нивата на възпаление и колкото по-болни са пациентите. Изводът, който Chakaroun и Kovacs правят от тези резултати: количеството и съставът на бактериите в мастната тъкан също допринасят за възпалението при пациенти с диабет тип 2 и хора с наднормено тегло.
Не е ясно как точно бактериите попадат във висцералната мазнина. „Червата е един от най-големите интерфейси с нашата среда“, казва Чакароун. „Известно е, че някои хранителни навици или консумацията на алкохол влияят върху чревната пропускливост.“ Освен това някои бактерии - например Enterobacteriaceae - произвеждат токсични липополизахариди, които също правят чревната стена по-пропусклива. По този начин бактериите в чревната флора могат лесно да мигрират в околната тъкан или да бъдат отмити. „В следващ проект ще измерим чревната пропускливост на пациентите, за да можем да докажем и това“, казва Kovacs.
Но дали няколко бактерии в мастната тъкан наистина са достатъчни, за да предизвикат имунна реакция и да разболеят хората? В крайна сметка изследователите изчисляват, че малкото количество бактериална ДНК в мастната тъкан е приблизително еквивалентно на една бактерия на всеки 100 адипоцита. Следователно, в модела на клетъчната култура те дразнят адипоцитите със сравнително количество бактериална ДНК. И ето - клетките реагираха с буря от възмущение и - в зависимост от концентрацията - освободиха възпалителните маркери IL-6 и TNFα.
Изследователите от Лайпциг планират да разгледат повече проби от тъкани в бъдеще. „Искаме да създадем един вид биобанка за този проект, в който контролът на органи върху здрави и с нормално тегло субекти, разбира се, ще бъде спасен“, казва Ковач. Засега това се провали поради етични опасения. Но има дискусия с клиниката за начините, по които все още ще бъде възможен достъп до здрава тъкан.
Съавторът на изследването Лукас Масие обаче засега вече няма да участва в последващи експерименти. „Това проучване увеличи пазарната му стойност и затова той беше назначен в института„ Каролинска “в Стокхолм, преди да защити докторската си дисертация,“ казва Ковач. Но дори там той продължава да изучава биологията на мастната тъкан.
Последни промени: 10/12/2020