Количествено определяне на хемотаксичната активност на моноцитите In vivo и характеризиране на кръвните моноцити

Обобщение

Тук представяме протокол за количествено определяне на хемотаксичната активност на кръвните моноцити в модели на мишки, за да се оценят ефектите от хранителни, фармакологични и генетични интервенции върху кръвните моноцити и получените от денмонцити макрофаги в модели на мишки с моноцит-хемоаттрактант протеин-1 (MCP-1) -заредени гел-тапи с вентилационна мембрана с вентилация.

Резюме

Въведение

Протокол

Всички методи, описани в този протокол, са одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните към Медицинското училище в Уейк Форест.

1. Приготвяне на разтвор, получен от базална мембрана, натоварен с MCP-1, намален растежен фактор

ЗАБЕЛЕЖКА: Това е стерилна процедура.

2. Инжектиране на разтвор, получен от сутеренна мембрана

3. Събиране на гел-тапа, получена от базата на мембраната

4. Смилайте гел-тапата, получена от базалната мембрана

5. Определяне на клетъчния състав в клетъчната суспензия с анализ на едноклетъчно Western blot (scWB)

6. Извадете чипа scWB

Представителни резултати

За достъп до хемолокантната реакция на кръвни моноцити, ние инжектирахме разтвор от дераста, получен от превозно средство, зареден с MCP-1, в левия и десния фланг на всяка мишка. Получените от базата мембрана гелни тапи бяха отстранени, отделени и клетките набрани във всяка тапа 1, 3 и 5 дни след инжектирането (Фигура 1А). Чрез изваждане на броя на клетките в заредения с превозно средство конектор (отворени ленти) от броя на клетките в заредения с MCP-1 конектор (затворени ленти), получихме броя на клетките, които бяха специално наети в отговор на MCP-1 (номер на клетка, Фигура 1B). Наблюдавахме ускорено набиране и натрупване на клетки за MCP-1 през 5-дневния период, като скоростите се увеличаваха от 31 000 клетки/ден (ден 1) до 78 000 клетки/ден (ден 3) и 136 000 клетки/ден на ден 5 (Фигура 1В).

Статистическата оценка на показаните тук данни се извършва със софтуер за анализ (напр. SigmaPlot 14). ANOVA, последван от LSD тест на Fischer, беше използван за сравняване на средните стойности между експериментални групи. Всички данни са представени като среден SD от поне 3 независими експеримента. Резултатите бяха на ниво P Фигура 1 : Количествено определяне на клетките, които наети в подкожни гел-тапи, получени от дермембрана в мазето ще. (А.) Абсолютни номера на клетки за заредени с превозни средства (отворени решетки) и заредени с MCP-1 базови мембранни гел тапи (затворени решетки). (Б.) Броят на клетките, наети от MCP-1 в гелни тапи, получени от клетъчна мембрана, се изчислява като разликата в броя на клетките между MCP-1 заредени и заредени с превозни средства тапи. Резултатите се показват като средно sD (n = 4). Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

количествено

Фигура 2 : Анализ на клетъчни популации, наети в гел-тапи, получени от базална мембрана чрез едноклетъчен Western blot анализ бяха. (A + B) Представителни примери за scWB анализ на натоварено превозно средство (Контрол) и конектор MCP-1 lende (MCP-1) са показани изолирани от мишка три дни след инжектирането. Чипове, маркирани с антитела към CD45, CD11b и F4/80, последвани от флуоресцентни вторични антитела, както е описано в протокола. Интензитетът на флуоресценция на маркираната лента за всяка отделна клетка е показан като площ на върха. (C + D) Клетъчните популации бяха идентифицирани като моноцити (CD11b + F4/80 -,), макрофаги (CD11b + F4/80 + плюс CD11b - F4/80 +,) или като немоноцитни левкоцити (CD45 +,). Останалите клетки бяха наречени „други“ (). Резултатите са показани като средно sD (n = 3). Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

количествено

Фигура 3 : Съдържание на моноцити и макрофаги в гелни тапи от Dererampen. Количествен анализ на набраните нива на моноцити и макрофаги в заредени с превозни средства и заредени с MCP-1 тапи, които бяха отстранени на дни 1, 3 и 5 след инжектирането. Стойностите се изразяват като процент от общата клетъчна популация (A + B) и в абсолютен брой клетки на съединител (C +Д.) се показва. Резултатите са показани като средно sD (n = 3). Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на това изображение.

Дискусия

Има редица ограничения за анализ, които трябва да се вземат предвид. Първо, манипулацията с мишка, включително анестезия, инжектиране на разтвори от базална мембрана и хирургично изплакване, изисква практика за генериране на отделни тапи и възпроизводими данни. Второ, докато повечето от клетките, които се набират в заредените MCP-1 щепсели, са моноцити и макрофаги, значителен брой не са. Това може да повлияе на интерпретацията на други, не единични клетъчни аналитични тестове, проведени върху тази клетъчна популация. Тъй като условията на клетъчен лизис за scWB са леки, разстоянията на миграция на протеините могат да се отклоняват от стандартните WB и не корелират с размера на протеина. Следователно, както лизисът на клетките, така и времената на работа трябва да бъдат валидирани за всеки нов протеин и първично антитяло, които трябва да бъдат тествани.