Индукция на атеросклеротични плаки чрез активиране на минералокортикоидни рецептори през
Обобщение
Ние описваме протокол за индуциране на атеросклероза в аортните корени на ApoE -/- мишки, хранени с атерогенна диета чрез непрекъснато освобождаване на алдостерон. Описани са също методи за характеризиране на състава на плаката.
Резюме
Въведение
Няколко проучвания показват, че алдостеронът участва в развитието на атеросклероза 8, 9, 10. Инфузията на алдостерон при ApoE -/- мишки, хранени с атерогенна диета, ускорява развитието на атеросклеротични лезии, предизвикващи възпалено аортно коренче и богато на липиди образуване на плака - 10 .
В обобщение, ние описваме протокол, включващ инфузия на алдостерон, атерогенно диетично хранене, вграждане на сърдечна тъкан, количествено определяне и характеризиране на атеросклеротични лезии при мишки ApoE -/-. Тази процедура насърчава ефективното образуване на възпалени, богати на липиди атеросклеротични плаки и представлява ценен модел за изследване на атерогенезата.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Протокол
Проучването е спонсорирано от Италианския национален институт по здравеопазване и комитети за употреба, Разрешение № 493/2016-PR. Всички процедури са извършени в съответствие с насоките на Европейската общност за използване на лабораторни животни (Насоки на ЕС 2010/63/UE).
Забележка: Подкожно имплантиране на осмотичната минипомпа с носител (етанол във физиологичен разтвор) или алдостерон (240 µg · kg -1 · d -1) при 8-10 седмични мъжки мишки, неадекватни за гена ApoE. Като цяло, 8-10 седмични мъжки мишки ApoE -/- тежат приблизително 25-26 g.
- Разтворете 5 mg алдостерон на прах в 1 ml абсолютен етанол.
- 68,3 µL физиологичен разтвор Добавете 56,7 µL алдостерон (разтворен в етанол), за да се получи концентрация от 2,27 µg/µL. напълнете изцяло цялата осмотична минипомпа със 125 µL от този разтвор (максималният капацитет на всяка мини помпа е 125 µL).
- Използвайте дебит на минипомпа от 0,11 µL/h; Следователно, 2,64 µL от разтвора се освобождава на всеки 24 часа.Дайте на всяка мишка около 6 µg · d -1 алдостерон за 28 дни.
(2) пълнене и имплантиране на осмотична помпа
Забележка: Помпите се състоят от две отделни части: основната част на помпата и регулатора на потока.
3. дисекция на сърцето
4. Изрежете участъци от аортния корен
ЗАБЕЛЕЖКА: Всички стъпки за оцветяване, докладвани в следващите протоколи, се извършват в кювети за оцветяване от стъкло Coplin.
(6) Анализ на изображението на атеросклеротични лезии в аортните коренни секции
Забележка: Корените на аортата, оцветени с Oil Red O или MAC3 или антитяло от интерес могат да бъдат обработени с помощта на подходящ софтуер Таблица на материалите), които да бъдат анализирани. Общото пикселно оцветяване, положително за интересуващия компонент, се нормализира спрямо общата площ на плаката. Изображенията бяха събрани и анализирани от заслепен изследовател на лечението.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
След 8-10 седмици Apo -/- мишките бяха имплантирани за инфузия с носител или алдостерон (Фиг. 1Е-1I) и хранени с атерогенна диета (коригирана калорична диета 42% от мазнини) в продължение на 4 седмици. В края на лечението мишките бяха евтаназирани и перфузирани с PBS с 10% формалин, както е описано по-горе. Коренът на аортата се отделя от апикалната част на сърцето и е вграден в OAT (Фигура 2). Напречните сечения на аортните корени бяха готови за различно оцветяване с помощта на криостатна машина (Фигура 3).
Съставът на атеросклеротичната плака може да се характеризира с оцветяване за определени компоненти, които определят етапа на развитие на плаката. Маслено червено O оцветяване се използва за определяне на съдържанието на мазнини в атеросклеротичните лезии, както е описано в стъпка 5.1, Picro Sirius червено оцветяване се използва за определяне на съдържанието на колаген, както е описано в стъпка 5.2, а Mac3 оцветяването се използва за измерване на съдържанието на макрофаги, описано в стъпка 5.3. След 4 седмици лечение с мишки с алдостерон значително увеличение на липидите (Фигура 4А-4 ° С) и съдържание на макрофаги (Фигура 4-4F), показани в атеросклеротични плаки на нивото на аортния корен, но не са наблюдавани разлики в съдържанието на колаген (Фиг. 4-4I) в сравнение с мишки, третирани с носителя. В действителност, в този модел алдостеронът ускорява атерогенезата, предизвиквайки съдово възпаление, но не и фиброза (Фигура 4).
Илюстрация 1: Подготовка и имплантиране на осмотична минипомпа с носител или алдостерон. ОТ) Стъпки за пълнене на осмотични мини помпи с превозно средство или алдостерон. ° С) Стъпки за затваряне на корпуса на помпата с регулатора на потока. D-F) Стъпки за създаване на разрез за имплантиране на помпата на гърба на мишката. G-me) Имплантиране на осмотична минипомпа и зашиване на разреза. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.
Фигура 2: Подгответе се за вграждане и изрязване на сърцето и аортния корен. ОТ) сърцето се изрязва напречно по права линия, свързваща долните точки на дясното и лявото предсърдие. Апикалната част на сърцето се обработва за количествено определяне на състава на атеросклеротичните лезии в аортния корен. ° С) коренът на аортата от сърцето. D-E) Сърдечната кухина е изпълнена с окт. Е) Ориентация на сърцето в дисектирана форма, предварително напълнена с OCT (със сърдечната кухина към дъното на фигурата) Ж) Замразяване на разрязаното сърце с ОСТ в матрицата. Моля, кликнете тук за по-голяма версия на тази фигура.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Дискусия
Атеросклерозата е хронично възпалително заболяване, което засяга големи и средни съдове с взаимодействия между множество видове клетки, като напр Б. Макрофагите, Т-лимфоцитите, ендотелните клетки и клетките на гладката мускулатура се разпределят към клетките 1. Въпреки ограниченията на мишите атерогенни модели, има много доказателства за атеросклеротичния процес. Тези модели имат предимството да генерират бързо експериментални кохорти от определена възраст и пол. Мишките също показват дефиниран и хомогенен генетичен произход.
Развитието на атеросклеротични плаки, наблюдавано при модели на мишки, склонни към артериосклероза, напомня отчасти на участниците, с изключение на наблюдаваното образуване на нестабилни плаки 4. При миши атерогенни модели не са наблюдавани руптура на плака и последваща тромбоза, основната причина за миокарден инфаркт при хората. В нашите публикации показахме, че инфузията на алдостерон за индуциране на нестабилен фенотип на плака при ApoE -/- мишки, хранени с HFD-10 след 4 седмици. В действителност, това лечение може да увеличи плаката, съдържанието на мазнини и нивото на възпалителна зона на аортния корен, без значителна разлика в сравнение с нетретираните мишки 10 съдържание на колаген. Имайте предвид, че тези мишки показват повишено развитие на атеросклероза, независима от хипертония, като се има предвид, че лечението с алдостерон на кръвното налягане не е значително променено.
В настоящия ръкопис показваме подробно техническата процедура за вграждане на сърдечна тъкан през октомври, както и последователните стъпки, т.е. H. Нарежете корен на аортата и анализирайте плаката. В сравнение с парафина, OCT дава възможност за подготовка на секции с висок диапазон на дебелина (1-100 µm) с криостат микротом и минимална обработка на тъканите. Ограниченията могат също да повлияят на качеството на замразената тъкан, което потенциално влияе върху образуването на ледени кристали и променя подклетъчните детайли и произвежда артефакти, откриваеми чрез имунохистологично оцветяване. Всъщност се смята, че криоконсервацията по-добре запазва антигена и антигенността. Всъщност замразената тъкан запазва структурата на антигените. Обработката на замразена тъкан за имунохистохимия позволява също така да се избягва използването на формалин, който е токсично и канцерогенно вещество, за да се избегне.
Забележката Когато се появят трите клапана, най-добре е да изрежете тъканта с различна дебелина в зависимост от вида на анализа, който се извършва. Всъщност някои слайдове се използват за определяне на прогресията на плаката, докато останалите диапозитиви могат да се използват за различни петна (напр. Picro Sirius, Mac3 и др.).
Атеросклеротичните лезии при мишки, лекувани с алдостерон, изглеждат богати на липиди, а макрофагите се характеризират с използването на Oil Red O (за оцветяване на липиди), Mac3 (за оцветяване на макрофаги), Sirius red (за оцветяване с колаген) или други специфични антитела от интерес Протеини. Важно е да се подчертае, че OCT вграждането, за разлика от влагането на парафин, избягва използването на органични разтворители, които премахват съдържанието на липиди в лезиите. Следователно липидното оцветяване с маслено червено О е възможно в секции с вграден ОСТ и съдържанието на мазнини в атеросклеротичните плаки може да бъде точно определено количествено.
В настоящия ръкопис показахме, че инфузията на алдостерон е ценен метод за насърчаване на атеросклероза при ApoE -/- мишки. Според инфузията на алдостерон в мишки ApoE -/- е в състояние: 1) да увеличи активирането на ендотелните клетки, представено от увеличената експресия на молекули, участващи в адхезията и миграцията на моноцити в ранните етапи на образуване на атеросклеротична плака 12, 13; и 2) съдържание на липиди и провъзпалителни макрофаги за увеличаване на аортния корен етап 10, 13. Тези ефекти не се дължат на хемодинамичните ефекти на алдостерон 10. В обобщение, предложеният протокол предоставя валиден метод за генериране и характеризиране на атеросклероза при мишки; Това може да наблюдава ранните стадии на заболяването и резултатите от терапевтичната интервенция и рехабилитация при атеросклероза.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.