In vitro и in vivo анализи на антиканцерогенната активност на куркумин и дететен куркумин am
От областта на човешката генетика, теоретична медицина и биологични науки или клинична медицина на Медицинския факултет на Университета в Саар, Хомбург/Saar In vitro и in vivo анализи на антиканцерогенната активност на куркумин и дететен куркумин върху миши злокачествен меланом Дисертация за получаване на степен доктор на Природни науки Медицински факултет UNIVERSITY DES SAARLAND 2014 подадено от: Индра Навина Дахмке род. на: 1 декември 1979 г. в Кобленц
Промоционален ден: Декан: проф. Д-р Доктор по медицина Менгер 1-ви репортер: проф. Д-р E. Meese 2-ри докладчик: PD Dr. M.W. Лашке
В памет на баща ми, който ме запозна с науката
Съдържание I Съдържание 1. Резюме. 1 2. Въведение. 5 2.1. Злокачествен меланом. 5 2.2. Куркумин. 6 2.2.1. Химични свойства на куркумина. 9 2.2.2. Фармакокинетика на куркумин. 10 2.2.3. Фармакокинетика на куркумин при хора. 11 2.2.4. Подобряване на бионаличността. 11 2.2.5. Токсичност. 12 2.2.6. Фармакодинамика на куркумин при хора. 12 2.2.7. Молекулни мишени на куркумин. 13 2.3. MiRNAs. 15 2.4. Собствен въпрос. 18 3. Материал и методи. 19 3.1. Лабораторни материали. 19 3.2. Клетъчни биологични методи. 19 3.2.1. Използвани клетъчни линии. 19 3.2.2. Култивиране на клетките. 19 3.2.3. Изолиране на първични човешки периферни мононуклеарни клетки. 20 3.2.4. Брой клетки. 21 3.2.5. WST-1 анализ. 22 3.2.6. Проточни цитометрични анализи. 22 3.2.6.1. Определяне на цитотоксичността. 24 3.2.6.2. Определяне на фазите на клетъчния цикъл. 25 3.2.7. Флуоресцентен микроскопски анализ. 25 3.3. Молекулярни биологични методи. 26 3.3.1. Изолиране на РНК от туморни проби. 26 3.3.2. Анализ с висока производителност на профила mirna. 27 3.3.3. In silico анализ на клетъчните сигнални пътища. 29 3.3.4. Количествена PCR в реално време от mirnas. 29 3.3.4.1. Обратна транскрипция. 29 3.3.4.2. Количествена PCR в реално време (qrt-pcr). 30-ти
Съдържание III 4.2.2. Пролиферация и апоптоза в дорзалния модел на кожната камера. 58 4.2.3. Растеж на тумора и неоангиогенеза в модела на фланг тумора. 58 4.2.4. Експресия на NF-κB при тумори на фланга. 60 4.2.5. MiRNA профил на фланговите тумори. 60 4.2.6. Експресия на релевантни mirnas в меланомни клетъчни линии. 64 4.2.7. Пътно регулирани сигнални пътища. 65 4.2.8. Мирни-205-5p цели. 66 5. Дискусия. 68 5.1. Ефекти на пиролитичните процеси върху куркумина. 68 5.2. Ефекти на хранителния куркумин върху меланома. 71 5.3. Заключение и перспективи. 79 6. Библиография. 81 7. Благодарности. 94 8. CV. 95 9. Публикации. 96 10. Приложение. 97
Списък на съкращенията IV Списък на съкращенията Фиг. Фигура Akt протеин киназа Akt, протеин киназа B al. alii APC Allophycocyanin APS амониев персулфат Bcl-2 В-клетъчен лимфом 2 BDMC Бидеметоксикуркумин bp basepare BRAF v-raf миши сарком вирусен онкоген хомолог B1, серин/треонинпротеин киназа B-Raf C въглерод Ca калций CD клъстер диференциация C циклинов C диференциран C комплект тирозин киназа KIT Cl хлорид c-myc myc миелоцитоматоза вирусен онкоген хомоложен COX-2 циклооксигеназа 2 CTLA-4 цитотоксичен Т-лимфоцитен антиген 4 Cur, CUR куркумин редист. двойно дестилирана DEPC диетилпирокарбонат DHC dihydrocurcumin ДКЦ decetene куркумин DMC demethoxycurcumin DMSO demethylsulfoxide ДНК deoxyribonuleic киселина дНТФ дезоксирибонуклеотидна трифосфат DTT дитиотреитол dutp 2-деоксиуридин ефективно епифит епизод 2-деоксиуридин преход една половина epiphosphate, преход рано mesoxyuridine, 5-към-1-трифосфат протеин концентрация 50, transymptive половината ефективно epiphosphate, 5-към-1 бифосфат протеин концентрация 50, transymptymium половина 1-трифосфат протеин 50 HER, EGFR рецептор на човешки епидермален растежен фактор/еритробластична левкемия вирусен онкоген хомоложен ESR1 естрогенен рецептор алфа FACS флуоресцентно активирано клетъчно сортиране FDA Администрация за храни и лекарства g Gramm G1 Gap1 G2 Gap2
Списък на съкращенията V GFP зелен флуоресцентен протеин Н водород ч час Хепес 2- [4- (2-хидроксиетил) пиперазин-1-ил] етансулфонова киселина HIF-1α Хипокси-индуцируем фактор-1 алфа hsa Homo sapiens ICAM-1 междуклетъчна адхезия протеин-1, CD54 IgG имуноглобулин G ip интраперитонеална IRAK1 интерлевкин-1-свързана рецепторна киназа 1 i.v. интравенозно IVM интравитална флуоресцентна микроскопия IκB инхибитор на капа В Ша килодалтона KEGG Киото Енциклопедия на гени и Genomes кг кг телесно тегло М 1 G малондиалдехид ДНК ma милиампери Ме метилова група мкг микрограма мкл микролитър цт микрометър минути мг милиграм мг магнезиев micorna. мегахерца мин мирис индуциран от mirna комплекс за заглушаване средно средно милилитър mm милиметър mmu Mus musculus mol Mol mrna messengerrna mtor бозайник мишена на рапамицин (серин/треонин протеин киназа) n номер Na натрий NF-κB ядрен фактор-каппа бета ng нанограм nm нанометър O кислороден атом ORA анализ на свръх представителство
Списък на съкращенията VI p53 туморен протеин 53 PAGE полиакриламиден гел електрофореза PBS буфер буфериран физиологичен разтвор PCAF P300/CBP-свързан фактор PCNA пролифериращ клетъчен ядрен антиген PCR полимеразна верижна реакция PECAM, CD31 тромбоцитна ендотелна клетъчна адхезия молекула PI пропидиев йодид p. o. per os PPAR-γ пероксизомен пролифератор-активиран рецептор-γ PTEN фосфатаза и тензин хомоложен PYR пиролизиран куркумин qrt-pcr количествена полимеразна верижна реакция в реално време РНК рибонуклеинова киселина S синтез. u. вижте по-долу SDS натриев додецил сулфат SEM стандартна грешка на средната SP1 специфичност протеин 1 транскрипционен фактор Src Тирозинкиназа Src (сарком) T ден t тон TBS-T Трис-буфериран физиологичен разтвор и Tween 20 TE Трис-EDTA буфер TNF-α тумор некрозис фактор- алфа TPA 12-O-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат Трис 2-амино-2-хидроксиметил-пропан-1,3-диол t-тест Студентски t-тест US ултразвук VAV прото-онкоген vav VCAM-1 молекула на адхезия на съдови клетки-1, CD 106 w/v тегло на обем WHO Световната здравна организация WST-1 водоразтворим тетразолий-1 xg n-кратно ускорение поради гравитацията напр. например C градуса по Целзий
Обобщение 2 и човешките меланомни клетъчни линии се провеждат чрез количествена полимеразна верижна реакция в реално време (qrt-pcr). Анализите на предполагаемите цели на мирнас, регулирани от хранителния куркумин, показват, че те са свръхпредставени в клетъчните сигнални пътища О-гликан биосинтез, обработка на протеини в ендоплазмения ретикулум и различни свързани с рака сигнални пътища. Western blot анализите показват, че антиапоптотичните В-клетъчни CLL/лимфом 2 (Bcl-2) и пролифериращи клетъчни ядрени антигени (PCNA) са значително понижени при лекувани с куркумин тумори на тези мишени. В обобщение, резултатите от тази работа демонстрират, че дететеновият куркумин, който е по-токсичен за раковите клетки от куркумина, се образува чрез пиролитично разграждане по време на нормалното готвене в домакинството. В допълнение беше демонстрирана фундаментална промяна в сигнатурата на mirna при трансплантирани меланоми, дължаща се на хранителния куркумин. Тук mmu-mir-205-5p беше най-регулиран. Доказано е влиянието на перорално прилагания куркумин върху важна регулаторна мрежа при тумори и подчертава потенциалната полза от куркумина при лечението на злокачествен меланом.
Резюме 4 са обогатени с биосинтез на о-гликан, ендоплазматична обработка на протеини от ретикулум и различни пътища, свързани с рака. Western blot анализите разкриват, че от тези прицелни антиапоптотични В-клетъчни CLL/лимфом 2 (Bcl-2) и пролифериращ клетъчен ядрен антиген (PCNA) са значително регулирани при лекувани с куркумин тумори. В заключение, констатациите от тази теза показват, че декетеновият куркумин, който се образува в резултат на пиролитично разграждане по време на обичайното готвене в домакинството, проявява по-силна токсичност върху раковите клетки в сравнение с куркумина. В допълнение, диетичният куркумин причинява дълбока промяна на подписа на mirna при присаден меланом, като mmu-mir-205-5p е регулиран най-значително. Въздействието на перорално прилагания куркумин върху важна регулаторна мрежа при тумори е документирано и подчертава потенциала на куркумина в терапията на злокачествен меланом.
Въведение 7 Фиг. 2: Curcuma longa. О: Чертеж на растението кукума (Köhler, 1887). B: Снимка на коренищата и куркума на прах. Наличният в търговската мрежа куркумин обикновено се състои от около 80% куркумин и също така съдържа междинни продукти за растителна биосинтеза с подобен спектър на действие, като деметоксикуркумин (
17%) и бидеметоксикуркумин (
3%) (Фиг. 3). Докато куркуминът се използва главно като оцветяваща хранителна добавка (E100, Natural Yellow 3) в Европа и САЩ, консумацията и употребата му в традиционната медицина са широко разпространени в Югоизточна Азия. Повече от 2000 години куркуминът се използва в традиционната азиатска кухня като основен компонент на къри и за оцветяване на сладкиши и се използва при медицинско лечение на инфекции и вътрешни заболявания (Ammon, 1991; Eigner и Scholz, 1999). С дял от 80% (около 800 000 т през 2010 г.), Индия е основният световен производител на куркума, 90% от която се преработва допълнително на вътрешния пазар (Universal Commodity Exchange, 2012). Средната консумация е 2,0-2,5 g куркума на ден и човек и съответства на прием до 100 mg куркумин (Chainani-Wu, 2003). За сравнение, Европейският орган за безопасност на храните във Великобритания изчислява, че 0,8-3,3 mg/kg телесно тегло на ден се консумират от възрастни (Европейски орган за безопасност на храните, 2010).
Въведение 10 различни пропорции на транс-6- (4-хидрокси-3-метоксифенил) -2,4-диоксо-5-хексанал, ферулова киселина, ферулоил метан и ванилин (Wang et al., 1997). Куркуминът е лесно разтворим в органични разтворители като алкохоли или деметилсулфоксид (DMSO), но само трудно във вода. Това води до намалена клетъчна абсорбция в червата и съответно до намалена бионаличност. 2.2.2. Фармакокинетика на куркумин Предклиничните и клинични проучвания върху фармакокинетиката на куркумин показват ниска системна бионаличност, както и бързо метаболизиране и екскреция на първичното вещество при първо преминаване. Едно от първите проучвания на Wahlström и Blennow (1978) показва, че перорално прилаганият куркумин при плъхове Sprague-Dawley активно се транспортира от черния дроб в жлъчката и 75% се екскретира с фекалиите. Само малка част се открива в плазмата и урината. Фиг. 6: Метаболизъм на куркумин (модифициран от Sharma, 2005) Билиарната екскреция на куркумин от своя страна се медиира от свързания с резистентност към различни лекарства протеин 2 (MRP2) (Lee et al., 2012). В ин витро експерименти също беше
Материалът и методите 21 се промиват със студен PBS и клетките след това се преброяват ръчно в камера за преброяване на Нойбауер (хемоцитометър). Буфер за лизис на еритроцити: 788 mg (10 mm) Tris-HCl 4.41 g (165 mm) NH 4 Cl химикали в 500 ml аква бидист. разтваря се и се съхранява при 4 С. 3.2.4. Преброяване на клетки За да се преброят клетките, 10 µl от клетъчната суспензия се смесват с 10 µl трипаново синьо (фактор на разреждане: 2) и жизнените (оцветени) клетки се преброяват в камера за преброяване на Нойбауер (Фиг. 10). Оцветителят трипан синьо прониква през увредените клетъчни мембрани и по този начин маркира нежизненоважни клетки. Втора 10 μl аликвотна част от клетъчната суспензия се смесва с разтвора на Turk и се добавя към преброителната камера на Neubauer, за да се определи броят на белите кръвни клетки. Оцетната киселина, съдържаща се в разтвора на Türks, лизира еритроцитите, така че те да се оцветят в синьо. Фиг. 10: Камера за преброяване на Нойбауер. О: Схематично представяне на хемоцитометър в напречно сечение. Б: Схематично представяне на зоната за броене. Квадрантите, които трябва да бъдат преброени, са очертани в червено (Woermann, 2000). За изчисляване на жизненоважните PBMCs трябва да се вземат предвид обемът на течността в преброителната камера и разреждането на клетките в оцветяващите разтвори. Областта
МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ 29 За да се намери нивото на експресия на mirnas между контролната и лечебната групи, беше използван независимият, двустранен t-тест на Student. Изчислените P-стойности бяха коригирани със степента на фалшиво откриване (FDR) за многократно тестване (Benjamini and Hochberg, 1995). Дерегулирани mirnas с коригирана стойност на P от 20%, диаметър на тумора> 15 mm и развитие на тъканна некроза. Освен ако не е описано друго, интервенциите се провеждат под интраперитонеална кетамин-ксилазинова анестезия (кетамин: 75 mg/kg, Ketanest, Pharmacia GmbH, Erlangen, Германия; ксилазин: 15 mg/kg, Rompun, Bayer, Leverkusen, Германия). След края на експериментите животните получиха предозиране на пентобарбитал (200
Материали и методи 46 Фиг. 18: Интравитална флуоресцентна микроскопия. Настройка на флуоресцентния микроскоп (FM) с лампа с живачни пари (HBO), лещи за дълги разстояния (LDO) и система за видеодокументация с видеокамера (VK) и DVD рекордер (DVD). Данните бяха оценени офлайн с помощта на софтуера CapImage (Zeintl, Хайделберг, Германия). Анализите включват измерване на размера на тумора [mm 2] и функционалната капилярна плътност [cm/cm 2]. Това се определя като общата дължина на перфузираните съдове за зрително поле. В тази работа е анализирана функционалната капилярна плътност на пълния туморен сфероид. 3.10. Модел на фланговия тумор Генерирането на фланговите тумори и ултразвуковите измервания са извършени с любезната подкрепа на Jeannette Rudzitis-Auth, Институт за клинично-експериментална хирургия, Университет Саарланд. 3.10.1. Генериране на флангови тумори За да се генерират флангови тумори, мъжките мишки C57BL/6 бяха анестезирани за кратко със смес от 4% изофлуран и кислород. Всяка мишка се инжектира подкожно с 1 × 105 B78H1 меланомни клетки на фланг в обем от 50 μl PBS.
Прилагат се материали и методи 50. При post hoc анализите алфа-грешката според Bonferroni е коригирана, за да се коригират повторни измервания. Стойност на P