Ензимна олигомеризация на хранителни протеини при места за реакция под високо налягане и
Ензимна олигомеризация на хранителни протеини под високо налягане: места на реакция и функционални последици ДИСЕРТАЦИЯ за придобиване на академична степен Doctor rerum naturalium (Dr. rer. Nat.) Представено във Факултета по математика и естествени науки на Техническия университет в Дрезден от Susanne Schuh Представено на 10 декември 2012 г. Дисертацията беше в от септември 2007 г. до юли 2012 г. в Професорството по хранителна химия.
Спор: 25 април 2013 г. Рецензент: проф. Д-р обратно нат. Д-р инж. хабил. Томас Хенле проф. Д-р обратно нат. Харшадрай Равел
Съдържание Съдържание Съдържание Таблица на фигури V Списък на таблици VIII Списък на съкращенията XI 1 Въведение и цели 1 2 Теоретични основи 3 2.1 Лизозим. 3 2.1.1 Механизми на действие на лизозима. 2.1.2 Възможни приложения на лизозима. 7 2.1.3 Модификация на лизозима. 8 2.1.3.1 Фибрили и амилоидни структури на HEWL. 9 2.1.3.2 Нови биологични функции чрез промяна на конформацията. 13 2.1.4 Еволюционно развитие и връзка с α-лакталбумина. 14 2.2 Ензимното омрежване. 15 2.2.1 Микробна трансглутаминаза. 15 2.2.1.1 Катализирани от TGase реакции и реакционен механизъм. 17 2.2.1.2 Аналитични аспекти. 19 2.2.1.3 Употреба в хранителната промишленост. 19 2.3 Неензимно омрежване. 21 2.3.1 Термично индуцирано омрежване. 21 2.3.2 Омрежване с нулева дължина In-Vacuo. 23 2.3.3 Възможни приложения на не-ензимно свързани протеини. 23 2.4 Ефект на високото хидростатично налягане върху протеините. 24 2.4.1 Ефект от високо налягане върху пилешки протеин лизозим. 26 2.4.2 Ефект от високото налягане върху микробната трансглутаминаза. 27 3 Експериментална част 29 3.1 Химикали, материали, устройства и софтуер. 29 3.1.1 Химикали. 29 3.1.2 Устройства и консумативи. 31 3.1.3 Изпитни материали. 33 3.1.4 Софтуер. 33 I.
Съдържание 4.6.2 Идентификация на образуваните изопептиди. 145 4.6.3 Сравнение на неензимното и ензимното омрежване на HEWL.146 4.6.4 Сравнение на вакуумното термично омрежване на HEWL с β-казеин и първите изследвания върху изолат на суроватъчен протеин. 149 4.7 Заключение на изследванията за ензимно и неензимно омрежване на различни протеини. 152 5 Резюме 154 6 Библиография 157 Публикации 172 Благодарности 173 Застраховане 174 IV
Списък на съкращенията LMW α-la β-lg Lys m/z Met min ML MM MM MO MPa MS mtgase NRT PBS PCR pdb rel. PE RP-HPLC rpm SDS-PAGE TCA TEMED TGase ThT TPCK Tris U UV Val WHO Z-Glu-Gly ZLCL проба с ниско омрежен лизозим с 1000 37 C Arnaudov and de Vries, 2005 ph 2.0; 57 С 4,0 ± 0,7> 5000 Wang et al. 2009a ph 2.0; 55 ° С
10 * 1000 * Frare et al., 2004 ph 2.0; 65 ° С
10 *> 600 * Cao et al., 2004 рН 4,5; Стайна температура; червен. HEWL, 90% етанол Goda et al., 2000 90% етанол, 10 mm NaCl, 25 C *, изчислено при използване на TEM изображения 2-5 1000-2000
2 Теоретични основи В допълнение, Menéndez (2006) успя да покаже, че при по-ниски температури от 20 С и 600 МРа времето, необходимо за 50% инактивиране, се увеличава до около 100 минути (шест пъти). Освен това ензимът е инхибиран измеримо само при стайна температура от 400 МРа или при атмосферно налягане от 60 С. Въз основа на тези констатации чувствителността на трансглутаминаза към налягане се увеличава с повишаване на температурите (20 C). По този начин инактивирането на mtgase се влияе повече от температурата, отколкото от налягането и следва реакция от първи ред (Lauber et al., 2001a). Пълното дезактивиране се извършва при атмосферно налягане след 2 минути и 80 ° С (Menéndez et al., 2006). Инактивацията, предизвикана от натиск, се основава на разграждането на α-спиралите в повърхността на ензима, което променя третичната структура, което от своя страна влияе върху свързването на субстрата (Menéndez et al., 2006). За разлика от HEWL, повторното сгъване след обработка с високо налягане изглежда непълно, тъй като загубата на активност продължава, когато налягането е намалено. 28
75%, T3516 Sigma-Aldrich, Steinheim Thymol 3209.1 Carl Roth, Karlsruhe TPCK-третиран трипсин от едър рогат добитък 10 000 BAEE единици/mg Sigma-Aldrich, протеин на панкреаса Steinheim, T1426 трихлороцетна киселина (TCA) аналитичен реагент VWR, Darmstadt N-Tris (хидроксим) метилглицин аналитичен клас Serva Elektrophoresis, Heidelberg (Tricin) тринатриев фосфат додекахидрат чист, па VEB Laborchemie, Apolda Tris (хидроксиметил) -аминометан (TRIS) буферен клас, A1379 AppliChem, Дармщат 30
3 Експериментална част 3.1.3 Тестови материали Таблица 3-4: Пептиди, протеини и протеинови смеси Име Спецификация, каталожен номер. Производител Lacprodan Alpha-10 (суроватъчен протеинов изолат) 45,1% α-лакталбумин 45,9% β-лактоглобулин ARLA Foods Ingredients amba, Viby, Дания Аспартилизин 94,30% синтез от Dr. M. Hellwig, TU Dresden Glutamylglycine G1970 Bachem Lysozyme от Hen Egg-White (HEWL)
70 000-96 500 U/mg, 62971 Sigma-Aldrich, Steinheim α-лакталбумин
85% изолация от суроватъчен протеин изолат (глава 3.4) α-лакталбумин от говеждо мляко> 85% Sigma-Aldrich, Steinheim β-казеин до Aschaffenburg (1963) Изолация от Dr. C. Парчефелд, TU Дрезден β-лактоглобулин от говеждо мляко
90% (СТРАНИЦА) Sigma-Aldrich, Steinheim Таблица 3-5: Микроорганизми от колекцията щамове на Allgemeine Biochemie, Technische Universität Dresden Име Спецификация Оцветяване според Gram Origin Bacillus sphaericus - грам положителна почвена проба Degussa (Antwerp) Bacillus subtilis - грам положителна Süßmuth, University of Hohenheim Eschen coli TG 1 грам отрицателен неизвестен Pseudomonas putida ATCC 17390 грама отрицателен Институт по микробиология, Университет в Хохенхайм Streptococcus lactis B 23/2/1 грам положителен неизвестен 3.1.4 Софтуер Таблица 3-6: Използван софтуер Приложение аминокиселинен анализ (ASA) Електрофореза (SDS-PAGE) Измерване на флуоресценция (ThT, ANS анализ) Приспособяване на кривата на гел хроматография (GPC), UV спектри (CD) Масова спектроскопия (ESI-TOF-MS) Програма за повърхностна хидрофобност (ANS) Chromstar 6.3, SCPA GmbH Totallab TL 120 v2006c, Wincats, USA FL Solutions, Hitachi UV/VIS спектри (конго червено) Aspect Plus 1.7 (1993-2000) Eurochrom 2000, версия 2.05, Knauer, Geräteechnik Berlin J-700 за прозорец s Стандартен анализ, версия 1.35.01, JASCO Corp. и CDPro, метод CONTIN Компютърно подпомагане на събирането на данни с помощта на ChemStation за LC 3D, Agilent Technologies, Böblingen Evaluation Data Explorer версия 4.0.0.1, Приложни биосистеми, Фостър Сити, САЩ Tecan i-control TM 33
3 Експериментална част Таблица 3-9: Концентрационни серии за разтвори за калибриране Концентрация L-глутаминова киселина-γ-хидроксамат [mm] Основен разтвор за калибриране [µl] Трис-ацетатен буфер [µl] UV абсорбция λ = 525 nm 2,5 1000 0 0,742 2,0 800 200 0,578 1,5 600 400 0,441 1,0 400 600 0,295 0,5 200 800 0,146 празна стойност 0 1000 - За разтвор на mtgase (40 U mtgase/100 ml) приблизително 50 mg mtgase в 10 ml 0,2 M Tris - разтворен ацетатен буфер. Калибриране 1 ml калибриращ разтвор се смесва с 1 ml стоп реагент и се измерва спрямо стойността на празната променлива при дължина на вълната λ = 525 nm (Фигура 3-2). Винаги се извършва двойно определяне. Фигура 3-2: Калибрираща линия: Зависимост на ултравиолетовата абсорбция при λ = 525 nm от концентрацията на L-глутаминова киселина-γ-хидроксамат 40
3 Експериментална част Фотометрично определяне 50 µl от водния разтвор на пробата се пипетира с 950 µl NaOH в епруветка на Eppendorf и се смесва с 500 µl разтвор на Lowry. След 10 минути инкубация при стайна температура се добавят 500 μl фолинов реагент и разтворите се хомогенизират. Абсорбцията се измерва след 2 часа инкубация при 660 nm в спектрофотометъра Ultrospec 1000 (Pharmacia Biotech, Freiburg). Линията за калибриране е създадена при същите условия с концентрация от 20 до 600 µg протеин/ml (Таблица 3-10 и Фигура 3-3). Таблица 3-10: Схема на пипетиране за калибриране за определяне на протеин съгласно концентрация на HEWL Lowry [µg/ml] HEWL изходен разтвор [µl] NaOH [µl] UV абсорбция λ = 660 nm празна стойност - 1000 0 20 20 980 0,066 ± 0,003 50 50 950 0,136 ± 0,015 100 100 900 0,250 ± 0,005 300 300 700 0,684 ± 0,060 400 400 600 0,827 ± 0,026 600 600 400 1,146 ± 0,032 Проба 50 * 950 - * 50µl от разтвора на пробата съответства на разреждане 1:20 въз основа на изпитвания обем Калибриране Фигура 3 -3: калибрационна линия, зависимост на ултравиолетовата абсорбция при λ = 660 nm от концентрацията на HEWL [µg/ml] 43
3 Експериментална част Таблица 3-15: Програма за разделяне за определяне на аминокиселини, литиева система Време [мин] Буфер 1 Буфер 2 Буфер 3 Буфер 4 Температура на колоната в пещ [C] 0 85 15 0 0 42 3 85 15 0 0 42 4 79 21 0 0 42 21 43 57 0 0 42 25 43 57 0 0 42 33 0 0 100 0 39 0 0 0 100 40 60 43 0 0 68 32 46 74 63 0 0 68 32 74 Идентификация и количествено определяне на изопептидите Растение: Pharmacia LKB Alpha Plus Колона: Катионообменна хроматографска колона 190 х 4.6 mm PEEK със смола 7 µm с 11% омрежване Буфер за проба: Натриев цитрат 0.2 N, ph 2.20 Инжекционен обем: 20-100 µl Елуенти: виж Таблица 3-16 Поток: 20 ml/h Програма за елуиране: виж Таблица 3-17 Детекция: Дериватизация след колона с нинхидрин, температура на намотката 135 C, измерване: 570 nm Реагент на нинхидрин: Sykam, Fürstenfeldbruck Поток на нинхидрин реагент: 0,18 ml/min Оценка: Chromstar 6.3 Таблица 3-16: Използвани буфери des Натриева система за определяне на Asp_Lys и Glu_Lys буферен състав моларност рН проба буфер натриев цитрат 0,2 2,20 1 натриев цитрат 0,2 3,16 2 натриев цитрат 0,2 4,03 3 натриев цитрат с натриев хлорид 1,2 6,14 4 натриев хидроксид 0,4 48
3 Експериментални части Измерване на параметри: Режим на сканиране: Режим на данни: EX WL: EM Начало WL: EM Край WL: Скорост на сканиране: Забавяне: EX Разрез: EM Разрез: PMT Напрежение: Отговор: Дължина на вълната Сканиране Излъчване Флуоресценция 370 nm 400 nm 600 nm 240 nm/min 0 s 5 nm 5 nm 700 V 0,01 s калибриране Фигура 3-4: Флуоресцентно измерване на калибрирането на ANS анализа с 1900 µl ANS разтвор (250 µm) и 100 µl проба, λ ех = 370 nm и λ em = 480 nm, необработен HEWL в сравнение с HEWL след фибрилация в продължение на 96 часа (според Wang et al., 2009b) при различни концентрации, коригирана стойност на празната стойност. Лекото увеличение на сигнала, когато концентрацията на необработената HEWL се увеличава, се основава на факта, че реагентът бяха налични малко по-хидрофобни места за свързване. В присъствието на фибрилиран HEWL обаче е установено значително по-силно, линейно увеличение (Фигура 3-4). 3.7.9.2 Анализ на конго червено Този тест, базиран на UV/VIS, открива увеличаването на абсорбцията на разтвор на конго червено при 540 nm в присъствието на амилоидни фибрили (Wang et al., 2009a). 58
3 Експериментална част 100 μm основен разтвор на тиофлавин Т се приготвя от 1,6 mg тиофлавин Т (ThT) в 50 ml PBS буфер. След това основният разтвор се разрежда 1:10 (v/v) с PBS буфер, за да се получи 10 μm ThT разтвор. Процедура 80 μl от 0,05% разтвор на проба за сила (v/v) се смесват с 1920 μl разтвор на ThT, хомогенизират се и се използват директно за измерване на флуоресценцията. При дължина на вълната на възбуждане 440 nm, емисионният спектър от 450 до 530 nm се записва на флуоресцентния спектрофотометър F-4500. За математическата оценка се използва интензитетът на флуоресценция при 485 nm. За да се определи празната стойност, се добавя физиологичен разтвор (рН 2.2, виж 3.3) вместо 80 µl пробен разтвор. Параметри на измерване: Режим на сканиране: Режим на данни: EX WL: EM Старт WL: EM Край WL: Скорост на сканиране: Забавяне: EX Разрез: EM Разрез: PMT Напрежение: Отговор: Дължина на вълната Сканиране Излъчване Флуоресценция 440 nm 450 nm 530 nm 6 nm/min 0 s 5 nm 5 nm 700 V 0,01 s калибриране Фигура 3-6: Калибриране на ThT анализа с 1920 µl ThT разтвор (10 µm) и 80 µl проба, λ ех = 440 nm и λ em = 485 nm, Необработен HEWL в сравнение с HEWL след фибрилация в продължение на 96 часа (според Wang et al., 2009b) при различни концентрации, празна стойност коригирана 60
4 Резултати и обсъждане на омрежване, 50-милиметровите буфери се представиха най-добре, с тримери в буфера Bis-Tris и следи от тетрамери в системата Tris. Също така би било възможно да се отбележи, че леко повишеното спадане на рН, наблюдавано в 50 mm Tris-HCl буфер, е първият показател за добро омрежване. Причината за намаляването на рН в резултат на омрежването е фактът, че някои основни аминокиселинни остатъци вече не са достъпни за разтворители след образуването на изопептидната връзка. Дискусия за засегнатите остатъци от лизин и глутамин и тяхната среда следва в глава 4.2.3. Въз основа на резултатите от различните буферни системи, най-високото омрежване на HEWL с mtgase може да бъде открито за 50 mm-tris-hcl-буфер, така че това беше избрано. Това означава, че стойностите на pH от 7,2 до 9,0 обикновено могат да бъдат постигнати с базирани на Tris буферни системи, тъй като споменатият буфер е стабилен в тези граници (Good et al., 1966). Освен това, избраната стойност на ph трябва да е подходяща за предвидените експерименти. Лизозимът има изоелектрична точка (pi) от
37,5 минути) и метионин (Met, Rt
43 минути) почти базови линии бяха открити отделно. В родния HEWL в този момент има 78
4 Резултати и дискусия Фигура 4-10: RP-HPLC на триптично усвоения HEWL: A - необработен HEWL; B - HEWL, обработен с mtgase в продължение на 30 минути при 40 C и атмосферно налягане; C - HEWL с mtgase за 30 минути при 40 C и 600 MPa (LMW) Таблица 4-8: Идентифициране на триптичните пептиди от нативния HEWL чрез RP-HPLC с ESI-TOF-MS Време на пик [min] m/z триптично [M + Н] + [М + 2Н] 2+ пептиди Теоретична пептидна маса 1 5,1 517,3-69-73 516,27 2 10,3 448,3-126-129 447,23 3 12,8 606,4- 1-5 605,36 4 13,0 874,5 437,7 15-21 873,41 5 13,5 776,4-117-123 775,35 6 14,5 1428,9 714,9 34-45 1427 .64 7 14.7 836.5-6-13 835.39 8 15.1 992.7 496 .8 6-14 991.49 9 16.5 1045.7 523.3 117-125 1044.53 10 16,9 936,5 468,7 62-68 935,37 11 17,0 1276,7 638,9 115-125 1275,64 12 17,4 1754,6 877,5 46-61 1752,83 13 19, 3 1268,7 634,9 22-33 1267,60 14 19,8 1805,1 902,6 97-112 1802,89 15 20,3 1676,4 838,5 98-112 1674,79 15 20,6 1676, 4838,5 98-112 1674,79 I 15,7 497,3 Неизвестен артефакт II 17,75 1288,9 Неизвестен артефакт Пептидните модели, които бяха открити при дължина на вълната 220 nm, не показват разлики за естествения лизозим (Фигура 4-10 А) и HEWL с mtgase за 30 минути 40 C при атмосферно налягане или високо хидростатично налягане (Фигура 4-10 B и C). Това показва, че 81-те, използвани за лечение на HEWL
4 Резултати и дискусия A 1202,2 m/z B 817,5 m/z C 1364,9 m/z 84
4 Резултати и дискусия D 1010,7 m/z E 1507,0 m/z F 1017,7 m/z Фигура 4-12: Масови спектри на шестте идентифицирани изопептидни последователности (A - F) след триптично разграждане при различно време на задържане (виж таблицата 4-9, третирани с mtgase в продължение на 30 минути при 600 MPa и 40 или 60 C) и техните изопептидни фрагменти (числата се отнасят до позициите на АА в HEWL последователността) 85
4 Резултати и дискусия за половината от нелекуваната HEWL. По този начин нарастващата степен на омрежване забавя образуването на ядра (плоско покачване), от една страна, и растежа на фибрилите (ниска максимална стойност), от друга. Изследванията на потенциала на мъждене потвърждават изразените по-рано очаквания на втората теория (Johnson et al., 2005 и Booth et al., 1997) за инхибирана тенденция към мъждене. ABC Фигура 4-33: Резултати от анализите ANS, Конго червен и ThT (A - C) с нетретиран и омрежен HEWL (LMW - 2% HEWL, 40 U mtgase/g протеин при 40 C, степен на омрежване: 8,5% и HMW - 3% HEWL, 160 U mtgase/g протеин при 60 C, степен на омрежване: 65%) след инкубация при pH 2.2, 55 C в продължение на 96 часа леко омреженото състояние (LMW) се утаява във фина, облачна утайка, докато необработеният HEWL образува груби агрегати (Фигура 4-34). В разтвора на силно омрежената HEWL (HMW), не се виждаха валежи във всеки един момент от времето, въпреки леко нарастващите сигнали, и концентрацията на фибрил, необходима за валежите, вероятно не беше достигната. 119
11) може да се постигне след четири цикъла с или без вакуум. 4.6.2 Идентификация на образуваните изопептиди След успешно термично омрежване с и без използване на вакуум (ZLCL), въпросът за участващите изопептиди трябва да бъде изяснен. Както вече споменахме, теоретично могат да възникнат два различни дипептида (Simons et al., 2002). От лизин (Lys) и 145