Дисертация за придобиване на академична степен на

Хаплотипове на витамин D рецепторния ген като фактори за чувствителност към колоректален карцином, както и in vitro анализ на експресия на гени, регулирани с витамин D Дисертация за придобиване на академична степен на доктор на природните науки (д-р рет. Нат.), Представена в Катедрата по биология, Химия, фармация на Свободния университет в Берлин, представена от Яна Флюге от Грайфсвалд, ноември 2008 г. 1. Рецензент: проф. Д-р Матиас Ф. Мелциг 2-ри рецензент: проф. Д-р Оспорване на корените на Ивар на 26 февруари 2009 г.

академична

Признание SNPlex тестовете са установени, извършени и оценени. Особено бих искал да благодаря на dipl. Biol. Sabrina Klare за прилагането на SNPlex и Dr. Solveigh Krusekopf за установяване и оценка на SNPlex и г-жа Anne Sülflow и г-жа Dipl. Biol. Kristin Krostitz за последователност на 3 SNP. Тази докторат е подкрепена финансово от Федералното министерство на образованието и научните изследвания (проект InnoRegio, номер на безвъзмездна помощ 03I4507, фармакогеномична оптимизация на лекарствената терапия и подпроект за разработване на лекарства карцином на дебелото черво) и Investitionsbank Berlin (проект ProFIT, грант номер 1013 3117, индивидуални рискови фактори за рак на дебелото черво, като се вземат предвид полиморфните генетични тестове за асоцииране включително голям брой мутации). Бих искал да изкажа специалните си благодарности на моите родители, д-р. Dipl.-Ing. Франк Флуге и инж. Инж. Евелин Флуге, сестра ми Dipl.-Chem. Сузане Флуге, баба ми Херта Флюге и баба ми и дядо ми Гюнтер Буков и Кристел Буков изразяват своята ценна подкрепа през цялото време на моето чиракуване, от училище, през проучвания до докторат и за подкрепа и насърчение във всички възходи и падения Работа. II

Съдържание Съдържание Благодарности. I Съдържание. III Списък на съкращенията. VII 1 Въведение. 1 1.1 Колоректален карцином. 1 1.1.1 Честота и смъртност. 1 1.1.2 Патогенеза на аденома-карциномната последователност. 1 1.1.3 Индивидуални и екологични рискови фактори, разположение и експозиция. 2 1.1.4 Генетични фактори и предразположение. 4 1.2 Витамин D. 5 1.2.1 Свойства. 5 1.2.2 Витамин D метаболизъм. 6 1.2.3 Връзка между витамин D и колоректален рак. 7 1.3 Витамин D рецептор. 8 1.3.1 Структура, структура и поява. 8 1.3.2 Режим на работа. 10 1.3.3 Полиморфизми на витамин D рецепторния ген, асоциации и молекулна характеристика. 11 1.3.4 Витамин D рецептор поли (А) микросателит. 12 1.3.5 Полиморфизми на гени, участващи в метаболизма на витамин D. 13 1.4 Издание. 14 2 Материал и методи. 15 2.1 Материали. 15 2.1.1 Проучване на популациите. 15 2.1.2 Клетъчни линии. 18 2.1.3 Устройства. 2.1.4 Химикали. 20 2.1.5 Решения. 23 2.1.6 Консумативи. 23 III

Съдържание 3 резултата. 57 3.1 VDR генни полиморфизми. 57 3.1.1 Клинични данни. 57 3.1.2 Резултати от генотипирането. 58 3.1.3 VDR двойки генотип. 59 3.1.4 Дисбаланс на VDR съединителя. 60 3.1.5 VDR хаплотипове. 61 3.1.6 Витамин D рецептор поли (А) микросателит. 63 3.2 Полиморфизми на гени, участващи в метаболизма на витамин D. 67 3.2.1 Клинични данни. 67 3.2.2 Резултати от мултиплексния анализ. 68 3.2.3 Съотношения на генотипите. 72 3.2.4 Анализ на свързването. 72 3.2.5 Сложни генотипове и хаплотипове. 74 3.3 Анализ на генна експресия с RT-PCR. 77 3.3.1 Индукционни експерименти (модел на диференциация). 77 3.3.2 Относително количествено определяне на мрна. 78 3.3.3 Експресия на VDR ген в Caco-2 клетки. 79 3.3.4 Експресия на CDH1 ген в Caco-2 клетки. 80 3.3.5 Експресия на VDR ген в SW480 клетки. 81 3.3.6 Експресия на CDH1 ген в SW480 клетки. 82 3.4 Анализ на генната експресия с микрочипове GeneChip. 83 3.4.1 Клъстер анализ. 83 3.4.2 Анализ на данни за регулираните гени (нива на сигурност). 84 3.4.3 Присвояване на регулираните гени. 85 3.4.4 Скатер. 85 3.4.5 Йерархичен клъстер анализ. 86 3.4.6 Анализ на избрани гени, регулирани с витамин D. 88 4 Дискусия. 92 4.1 VDR генни полиморфизми. 92 4.1.1 Влияние на полиморфизмите на генните рецептори за витамин D върху чувствителността към колоректален карцином (проучване на случая-контрол). 92 V

Съдържание 4.1.2 Влияние на дисбаланса на връзката, сложни генотипове и хаплотипове. 95 4.2 Полиморфизми на гени, участващи в метаболизма на витамин D. 100 4.3 Анализ на генната експресия. 102 4.3.1 Интерпретация на резултатите от анализа на генната експресия с RT-PCR след индукция в клетъчни култури (модел на диференциация). 102 4.3.2 Технически проблеми и преносимост. 104 4.3.3 Избор на референтни и кандидат-гени. 105 4.3.4 Качествен контрол и анализ на данните за резултатите от микрочиповете. 106 4.3.5 Експресия на VDR и CDH1 след анализ на микрочипове. 106 4.3.6 Интерпретация на резултатите от анализа на генната експресия с микрочип GeneChip. 107 4.3.7 Модел на генна регулация от витамин D. 112 4.4 Перспективи и перспективи. 113 5 Резюме. 114 6 Библиография. 118 7 Списък на публикациите. 132 CV. 134 Афидавит. 135 VI

Списък на съкращенията Списък на съкращенията Съкращение Acc. Не. ACTB ATRA β-me bp BMI BSA CDH1 CDS CI crna CV CYP CYP24A1 CYP27A1 CYP27B1 d ddntp DMEM DMSO DNA dntp dsdna EDTA EtOH fcrna FCS Значение Номер на присъединяване бета-актин изцяло транс-ретиноева киселина бета-меркаптоетанол база Индекс на телесна маса Говежди серумен албумин Е-кадхерин кодираща последователност Доверителен интервал допълваща РНК Коефициент на вариация Цитохром P-450 Цитохром P-450 24A1 (цитохром P450, семейство 24, подсемейство A, полипептид 1), витамин -D 3-24-хидроксилаза цитохром P-450 27A1 (цитохром P450, семейство 27, подсемейство A, полипептид 1), витамин-D 3-25-хидроксилаза цитохром P-450 27A1 (цитохром P450, семейство 27, подсемейство B, Полипептид 1), 25-хидроксивитамин D 3-1-алфа-хидроксилаза ден 2,3-дидеоксинуклеотиди Dulbecco s Modified Eagle s среда диметилсулфоксид дезоксирибонуклеинова киселина дезоксирибонуклеотид 5 трифосфат Двуверижна ДНК етилен диамин тетраацетатен етанол фрагментиран етанол m (фетален телешки серум) VII

Списък на съкращенията g g GAPDH gdna Gl. h hap hm ht HWE глава. kb KG LD M MAF MES mrna mut MW n N.A. NaB NaCl n.d. NR n.s. nt OD или PBS PCR QC ускорение поради гравитацията грамове глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа геномна ДНК уравнение час хаплотип хомозиготен хетерозиготен Харди-Вайнберг глава за равновесие сложни генотипи свързване дисбаланс (свързване неравновесие) минорен алфел киселина честота сулфел киселина сулфал RNA (messenger RNA) мутирала средна стойност размер на пробата не е посочен натриев бутират натриев хлорид не се откриват ядрени рецептори не са значими нуклеотиди оптична плътност съотношение шансове фосфатно буфериран физиологичен разтвор полимеразна верижна реакция контрол на качеството VIII

Списък на съкращенията r Коефициент на корелация RAR рецептор на ретиноева киселина РНК рибонуклеинова киселина RFLP рестрикционен фрагмент дължина полиморфизъм RLT буфер, съдържа силно денатуриращ гуанидин изотиоцианат (GITC) обороти в минута (обороти в минута) ROH ретинол rrna рибозомна РНК RT-обратна транскрипция Svedberg (единица, коефициент на утаяване) SD стандартно отклонение (стандартно отклонение) сек секунди ssdna едноверижна ДНК (едноверижна) SNP еднонуклеотиден полиморфизъм Taq Thermus aquaticus TBE Tris-борат-EDTA буфер TE Tris-EDTA буфер Tris Tris- (хидроксиметил ) -аминометан трна трансфер-РНК U единица, единица UV ултравиолетова светлина VDR витамин D рецептор wt див тип 1α, 25 (OH) 2 D 3 витамин D, 1,25-дихидроксивитамин D 3, калцитриол 3 -, 5 -UTR 3 -, 5 - нетранслиран регион 7-DHC 7-дехидрохолестерол IX

Материали и методи, предоставени от института ggmbh i.gr., Берлин-Хенигсдорф. Преглед на характеристиките на тумора и класификацията на TNM е даден в таблица 3. Таблица 3 Разположение на тумора, хистология на тумора и класификация на TNM при 452 пациенти с рак на дебелото черво (група II) Разположение на тумора n% Цекум 32 7.1 Възходящо дебело черво 51 11.3 Напречно дебело черво 5. 5.8 Низходящо дебело черво 16 3.5 Сигмоидно дебело черво 22 22.6 Ректум 214 47.3 Други 11 2.4 Хистология на тумора Аденокарцином 414 91.6 Муцинозен аденокарцином 28 6.2 Други 10 2.2 Степен на диференциация Слаба 78 17.2 Умерена 330 73.0 Добър 31 6.9 Недиференциран 13 2.9 Туморен стадий (pt) pt1 Субмукоза 22 4.9 pt2 Muscularis propria 109 24.1 pt3 Subserosa 267 59.1 pt4 Други органи/перфорации 54 11.9 Метастази в лимфните възли (pn) pn0 Няма метастази 211 46,7 pn1 1-3 лимфни възли 126 27,9 pn2 4 или повече лимфни възли 102 22,5 Други 13 2,9 Далечни метастази (pm) pm0 Няма отдалечени метастази 346 76,6 pm1 Отдалечени метастази 100 22,1 Други 6 1,3 Контролната група състоял се от пациенти с не-злокачествени заболявания. Пробите са събрани от Института по клинична фармакология и токсикология към Charité Universitätsmedizin Berlin. Всички участници в проучването бяха информирани за съдържанието и целите на изследването и дадоха своето писмено съгласие. 17-ти