ДИСЕРТАЦИЯ за получаване на докторска степен в катедрата по химия
1 Определяне на аминокиселинните продукти на радиолизата орто-тирозин и 3- (4-хидроксифенил) пропионова киселина като доказателство за γ-облъчване на храни, богати на протеини представена от Jana Huňkova от Кладно Хамбург 23
2 Настоящата работа е извършена между октомври 1998 г. и 22 септември под ръководството на професор д-р. Д-р Ханс Щайнхарт от Института по биохимия и химия на храните - катедра Химия на храните. 1-ви рецензент: проф. Д-р Д-р Ханс Щайнхарт 2-ри рецензент: проф. Д-р Биспинг
3 Благодарности На този етап бих искал да благодаря на всички, които ме подкрепиха при изготвянето на тази теза: проф. Д-р. Д-р Бих искал да благодаря на Ханс Щайнхарт за предоставената тема и голямата подкрепа. Професор доктор. Благодаря на Bisping, че пое презентацията. Д-р Бих искал да благодаря на Томас Симат за постоянната му готовност за обсъждане и сътрудничество, което допринесе за успеха на тази работа. Бих искал да благодаря на всички колеги от катедрата по химия на храните в университета в Хамбург за доброто сътрудничество. Бих искал да благодаря на компаниите Beiersdorf AG и GAMMASTER GmbH за облъчване на пробите. Благодаря на Daimler-Benz и фондацията на Х. Вилхелм Шауман за финансовата подкрепа на тази работа. Благодаря на родителите си за тяхното неизчерпаемо търпение. Бих искал да благодаря на моите приятели Рут, Иржи, Робърт, Брита, Астрид, Керстин, Луи и Марияна за корекционната работа и друга разнообразна подкрепа.
4 Списък на съкращенията 4 Списък на съкращенията 3,2-HPPA 3,3-HPPA 3,4-HPPA λ Ex λ Em AP-ESI BgVV CV Em ESR EU Ex FAO FIA FL FLD GC HCl HPLC IAEA IS kgy LMBG M m/z MeCN MeOH мин MS MSD MW n 3- (2-хидроксифенил) -пропионова киселина 3- (3-хидроксифенил) -пропионова киселина 3- (4-хидроксифенил) -пропионова киселина Дължина на вълната на възбуждане Емисия Дължина на вълната Атмосферно налягане Електроспрей Йонизация Федерален институт за защита на потребителите Здравеопазване и ветеринарна медицина Ефективност Електронна спектроскопия Ефективност Електронна емисия Електронна спектрометрия Ексцентрация на емисиите Електронна спектрометрия Ексцентрация на емисиите Електронна спектроскопия и организация на земеделието Инжекционен анализ Флуоресценция Флуоресценция Откриване Газова хроматография Солна киселина Висококачествена течна хроматография Международна агенция за атомна енергия Вътрешен стандарт Кило сиво Закон за храните и стоките Молекулна маса Маса за зареждане Ацетонитрил Метанол Минути Масова спектрометрия Маса Селективен брой Средно количество проби
5 Списък на съкращенията 5 n.n. n.b. NH 4 ацетат NH 4 формиат NWG PE Phe RP RT SIM SPE TFA TL Tyr UV v/v WHO WFR не се открива не е определено амониев ацетат амониев формиат граница на откриване полиетилен фенилаланин обратна фаза стайна температура единичен йон мониторинг твърда фаза екстракция трифлуороцетна киселина термолуминесценция тирозин ултравиолетов обем коефициент на възстановяване Световна здравна организация
6 Съдържание 6 Съдържание 1 ВЪВЕДЕНИЕ ЦЕЛ ТЕОРЕТИЧНИ ПРИНЦИПИ Облъчване на храната Химически ефекти на йонизиращото лъчение Първичен ефект на облъчването Вторичен ефект на облъчването Влияние на дозата на облъчване Влияние на скоростта на дозата Влияние на температурата по време на облъчването Промяна на храната по време на замразяването МАТЕРИАЛ Шрайп РАЗРАБОТВАНЕ НА МЕТОДИ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА О-ТИРОЗИН Оптимизиране на хроматографските условия Оптимизиране на откриването Детектиране на флуоресценция (FLD) Масово селективно откриване (MSD) Разработване на почистване Депротеинизация Хомогенизация Изолиране на о-тир чрез екстракция с твърда фаза Дискусия на РАЗРАБОТВАНЕ НА МЕТОД -ХИДРОКСИФЕНИЛ) -ПРОПИОННА КИСЕЛИНА Оптимизиране на хроматографските условия. 43
7 Съдържание Оптимизиране на откриването Разработване на почистване Депротеинизация Изолация и обогатяване на 3- (4-хидроксифенил) пропионова киселина чрез екстракция течност-течност Изолиране и обогатяване на 3- (4-хидроксифенил) пропионова киселина чрез екстракция в твърда фаза Валидация Дискусия ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ФЕНИНАЛ И Р-ТИРОЗИН В БОГАТА С ПРОТЕИНИ ХРАНА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА О-ТИРОЗИН В γ-облъчена ПРОТЕИНОБОГАТА ХРАНА Влияние на температурата Определяне на о-тирозин при RT-облъчени храни, богати на протеини Определяне на о-тирозин в замразени, облъчени храни, богати на протеини Влияние на скоростта на дозата Влияние на скоростта на дозата Влияние на дозата на облъчване - остъкляване на фоново съдържание на о-тирозин в не облъчени проби Връзка между съдържанието на фенилаланин и индуцираното от радиацията образуване на о-тирозин ОПРЕДЕЛЯНЕ НА 3- (4-ХИДРОКСИФЕНИЛ) -ПРОПИОНОВА КИСЕЛИНА В γ-облъчена ПРОТЕИН-БОГАТА ХРАНА Връзка между съдържанието на р-тирозин и индуцираното от радиация образуване на 3- (4-хидроксифенил) пропионова киселина РЕЗЮМЕ НА ДИСКУСИЯТА - РЕЗЮМЕ Резюме Резюме ЛИТЕРАТУРА. 82
9 Съдържание Анионообменници Валидиране на процеса за определяне на 3- (4-хидроксифенил) пропионова киселина Определяне на 3- (4-хидроксифенил) пропионова киселина в γ-облъчени храни, богати на протеини Резултати от γ-облъчване на храни Определяне на 3- (4-хидроксифенил) - хроматограми на пропионова киселина. 125
14 1 Въведение 14 реагират същите продукти на окисляване. Новият подход за идентифициране на γ-облъчени богати на протеини и в същото време храни с ниско съдържание на мазнини предлага определяне на новия потенциален радиационен маркер 3,4-HPPA. Въз основа на скрининг, KLEEBERG (22) открива този продукт за радиолиза на аминокиселини в различни γ-облъчени храни, богати на протеини, като скариди от Северно море, пилешки гърди и други видове скариди. Този радиационен маркер се открива както при стайна температура, така и в замразени облъчени храни. Установени са значителни разлики между нивата от 3,4-HPPA в необлъчени и облъчени проби. 3,4-HPPA се определя с помощта на HPLC/FLD. Тази процедура досега не можеше да се използва като рутинна процедура.
16 3 Теоретични основи 16 3 Теоретични основи 3.1 Облъчване на храните За облъчване на храни са разрешени три различни вида радиация (CODEX ALIMENTARIUS, 1984): γ-лъчите на радионуклидите 6 Co (изкуствено произведени от 59 Co, две γ-кванти също са излъчвани с енергия от 1,17 MeV и 1,33 MeV) γ-лъчи на радионуклиди 137 Cs (от ядрено делене се излъчва γ-квант с относително ниска енергия от .66 MeV) β-лъчи до енергия от 1 MeV рентгенови лъчи (вторично излъчване от електронен ускорител) до енергия от 5 MeV. За облъчване на храни най-често се използват γ-лъчи, тъй като те имат висока проникваща способност за веществото в сравнение с β-лъчите и следователно са подходящи за облъчване на продукти върху палети (DIEHL, 1995). В зависимост от областта на приложение на радиацията се използват различни дози на радиация между .5 и 1 kgy. Диапазонът на високите дози над 1 kgy не е одобрен за търговски храни, но се използва за специални цели за стерилизация. Някои области на приложение с максимално разрешените дози радиация са изброени в таблица 2 (IAEA, 2).
18 3 Теоретични принципи 18 радиолитично разделени, със следните продукти на радиолиза, които се срещат по същество (ур. 4) (DRAGNIC and DRAGNIC, 1963, VON SONNTAG, 1987, DODD, 1995): H 2 O OH + e - aq + H + H 3 O + (уравнение 4) Вторичен ефект на радиацията Свободните радикали, образувани от първичния ефект на йонизиращото лъчение, са много реактивни и могат да реагират помежду си или с хранителните съставки, което води до вторичните продукти на радиацията. Получените видове могат да продължат да реагират по следния начин (ур. 5, 6, 7): R + H RH комбинация (ур. 5) R + R RR димеризация (ур. 6) RH + + e - aq RH улавяне на електрони (ур. 7 ) Хидроксилните радикали като първични продукти за радиолиза на водата имат силно окислително действие. Те са особено реактивни спрямо ненаситени съединения и тези с ароматни пръстени (KARAM и SIMIC, 1989, WANG et al., 1993). Когато ОН радикал атакува Phe, се получава добавяне към ароматния пръстен, като се образуват четири възможни междинни съединения (Фигура 1). Три от тях (1, 2, 3) водят до образуването на хидрокси-Phe, докато Ipso формата (4) води до неизвестни продукти (WANG et al., 1993). Фигура 1: Образуване на хидрокси-Phe радикалите чрез първични и вторични ефекти
23 3 Теоретични основи 23 Нормализиране на храносмилателните функции в (GUTSCHMIDT, 1964). Ензиматично свободните мастни киселини се освобождават от липидите. Образуването им е температурно зависимо и по-бавно при по-ниски температури, отколкото при по-високи. Ензимите обикновено не се разрушават от процеса на замразяване. Те могат да бъдат напълно активни отново, когато температурата се повиши. Ензими за разваляне на мазнини, напр. Липазите и липоксидазите са все още активни дори при ниски температури и водят до образуването на продукти от разграждането на мазнините (алдехиди, кетони, киселини, пероксиди) и до разграждането на фосфатидите (HERRMANN, 197).
31 5 Разработване на методи за определяне на о-тирозин 31 3 Дължина на вълната (nm) възбуждане максимална емисия максимална стойност на фигура 5 Фигура 5: Влияние на стойността на ph върху максималната възбуда и емисия Оптимизация на интензивността на флуоресценцията Флуоресцентните свойства на изомерите на Tyr зависят от стойността на ph . Поради тази причина беше изследвано влиянието на стойността на рН на буфера върху интензивността на флуоресценцията на о-тира и по този начин също върху чувствителността на откриването. За тази цел разтворите на о-тира във фосфатния буфер със стойности на рН между 1,5 и 9,3 бяха измерени флуориметрично (λex = 275 nm, λem = 35 nm). Установено е, че интензивността на флуоресценцията достига своя максимум в диапазона на рН 4-5 (Фигура 6). Интензитет на флуоресценция (%) ph Фигура 6: Зависимост на интензивността на флуоресценция на o-tyr от стойността на ph Следващата процедура беше използвана за прехвърляне на резултатите, получени с фосфатен буфер, в тестваните подвижни фази. Разтвор на o-tyr в този, разработен от HEIN et al. (2) използван елуент, 1% TFA (рН 1,8) също се измерва флуориметрично (λex = 275 nm, λem = 35 nm). O-tyr също е изследван в разтвор на .5 mol/l NH4формат при рН 3, 4 и 4.5. Максималната интензивност на флуоресценция се получава с разтвор на о-тир в NH4форматен буфер при рН 4