ДИПЛОМНА ТЕЗА. Биологична активност на новосинтезирано производно на тиокарбонова киселина (MAH4 HCl) върху изолирани органи от морски свинчета
1 ДИПЛОМНА ТЕЗА Биологична активност на новосинтезирано производно на тиокарбонова киселина (MAH4 HCl) върху изолирани органи от морски свинчета Автор Özlem Çetinkaya Желана академична степен Magistra der Pharmazie (Mag.pharm.) Виена, 2012 Номер на изследване според учебния лист: A 449 Поле на изследване според учебния лист: A 449 Ао. Унив.-проф. Д-р Кристиан Студеник
2 За моето семейство и Бернхард
3 Благодарности Преди всичко бих искал да благодаря на родителите си Фърдс и Мехмет Четинкая, братята и сестрите си Ейлем, Ейлен, Йозден и Мурат, както и на годеника си Бернхард, който застана зад мен през целия курс. С моя ръководител Ао. Унив.-проф. Д-р Благодаря на Кристиан Студеник от сърце за ценните импулси и за страхотната, човешка и компетентна подкрепа. Бих искал също да благодаря на г-н Ао. Унив.-проф. Д-р Томас Еркер и работната група на Катедрата по медицинска/фармацевтична химия за предоставяне на тестваното вещество. Бих искал също да изкажа сърдечни благодарности на моите приятели Алма Сейдинович, Милада Авдич и Хамди Канан за тяхната активна подкрепа. С тях обучението в библиотеката на AKH беше много по-забавно. Винаги си бил с мен в добри и лоши времена и винаги ще имаш чудесно място в сърцето ми. След това бих искал да благодаря на моите роднини, Мастал, за голямата им подкрепа при коректурата на тезата.
4 Съдържание 1 Въведение Сърдечна хипертония Сероводород Цели Материал и методология Тестово вещество MAH4 HCl Разтворител Експериментални животни Физиологичен разтвор на електролитни органи Използвани Подготвителни материали Използвано дясно предсърдие Белодробна артерия Папиларен мускул (Musculus paterialis) Малка черва (Ileum Terminalis Apparatura Apparatura Аппаратура Aputa Aptaineta Apparatura Аппаратура на аортния край на уреда Аппаратурна аормина Аппаратура Апаратура на долната част на аортата Инерция на крайния апарат Карбоген Извършване на експериментите Ефект на веществата върху изолираните органи на морски свинчета Atrium dexter (дясно предсърдие) Musculus paterialis (папиларен мускул) Терминален илеум (тънко черво) Аорта низходяща белодробна артерия (белодробна артерия)
5 3.6.2 Изследвания на механизма на действие на МАХ 4HCL в червата Изследвания с глибенкламид и нитро-L-аргинин Оценка на данните и статистиката Atrium dexter Musculus paterialis Aorta, Arteria pulmonalis, Terminalis ileum Статистически резултати Резултати от изследваното вещество MAH 4HCl Atterum cortulus de низходяща белодробна артерия терминален илеум Изследване на механизма на действие на изследваното вещество MAH4 HCl върху червата Ефект на MAH4 HCl в комбинация с NO-L-аргинин върху червата Ефект на MAH4 HCl в комбинация с глибенкламид върху червата Дискусия Резюме Библиография Автобиография
15 3 Материал и методология 3.1 Тествано вещество Веществото, което трябва да се тества, е тествано във Факултета по природни науки към Катедрата по лекарствена/фармацевтична химия от Ao. Унив. Професор доктор. Томас Еркер, наскоро синтезиран и предоставен за тестване MAH4 HCl Фигура 1: Химична структура на MAH4 HCl MG: 297,89 g/mol октил [2- (диметиламино) етокси] метантоат хидрохлорид 10
3.1.2 Разтворител За да се проведат експериментите, веществото трябва предварително да се разтвори напълно в подходящ разтворител. MAH4 HCl беше много бързо и напълно в дист. Водно разтворим. Първоначалното тегло винаги е било избрано така, че да се постигне концентрация от 100 µmol/l в съда в ваните за органи след пълното кумулативно добавяне. Наличните вани за органи са 8 ml и 25 ml. Изчисление: MG/4/100 = изчисление за големия съд MG/12,5/100 = изчисление за малкия кораб Таблица 2 показва изчислените и използвани изходни разтвори: Таблица 2: Основни разтвори Вещество Моларна маса MAH4 HCl 297,89 g/баня с обем мол в първоначалното тегло на изпитваното вещество (100 μmol/l)/ml баня за органи 80, 74 Основните разтвори се добавят на всеки четиридесет и пет минути с помощта на финска микропипета и ефектът се измерва. Добавените концентрации са показани в Таблица 3 по-долу. Таблица 3: Представяне на схемата за пипетиране Добавено количество Крайна концентрация 3 µl 3 µmol/l 7 µl 10 µmol/l 20 µl 30 µmol/l 70 µl 100 µmol/l 11
21 Фигура 4: Схематично представяне на сърцето (Netter FH 2003) 16
23 бяха спечелили 3 см дълго парче. Изолацията трябваше да се извършва много внимателно, тъй като можеше да нарани и преразтегне аортата. След това аортата, както и всички други препарати, беше поставена в чаша на Петри с Tyrode и фиксирана към корковата подложка с две дисекционни игли. Трябваше да се уверите, че не е пренапрегнато. Околната тъкан, мазнини и кръв бяха внимателно отстранени и нарязани на парчета с дължина приблизително 2 mm. Дефектните и неправилни части бяха изхвърлени. Фигура 6: Схематично представяне на аортата (Netter FH 2003) 18
24 3.5 Използвани апарати В експериментите са използвани два различни апарата. В апарат 1 бяха проведени експерименти за папиларни мускули и в апарат 2 аортни, предсърдни и чревни експерименти. Органите бяха окачени на преобразуватели на сила върху сребърна жица. Преобразувателят на сила преобразува механичната сила в електрически сигнал и я предава на усилвател, който усилва електрическия сигнал и го рисува върху милиметрова хартия с помощта на писалка. За да може да се сравняват експериментите, човек винаги е трябвало да работи при едни и същи условия по отношение на доставката на кислород, температурата, стойността на рН, производството и състава на Tyrode. Конструкция: Апаратът съдържа водна баня от акрилно стъкло. В тази водна баня се подава мускулна камера. Има и статив, към който са прикрепени преобразувателя на сила, финото задвижване и държачът на органа. За по-добро разбиране вижте фигура 6. 19
25 Фигура 7: Скица на апарата 1 Мускулната камера съдържа 25 ml, така че същият обем е използван за Tyrode. Водната баня беше термостатично контролирана до постоянна температура 35 ° C. Това създаде физиологични условия. Хранителният разтвор трябваше да бъде настроен на тази стойност, поради което Tyrode беше поставен в камерата 10 минути преди експеримента. Препаратът е описан преди това в глава. Мускулният препарат беше поставен в контакт с преобразувателя на сила със сребърната кука върху сребърна жица, папиларният мускул беше затегнат между електрода и диск от плексиглас. След това държачът беше спуснат в мускулната камера, така че образецът стоеше изцяло в Тирода. Папиларните мускули не бият спонтанно като атриума, но трябва да бъдат стимулирани. Това беше постигнато със стимулатор Accupulser (модел Isostim 301T. WPI, Hamden, CT, USA). Контракцията се предава на силовия преобразувател чрез сребърно-хлоридния проводник, усилва се в усилвателя и се предава на плоската писалка. 20-ти
26 Фигура 8: Оригинално изображение на апарат Апарат 2 Апарат 2 (виж Фигура 8) е използван за тестовете на аортата, белодробната артерия, крайния илеум и дясното предсърдие. Водната баня беше доведена до 37 ° C. В случая на аортата и белодробната артерия образци с пръстеновидна форма бяха прикрепени директно към преобразувателя на сила, използвайки сребърна жица. В червата и атриума две сребърни куки преди това бяха прикрепени към два края и те също бяха свързани към преобразувателя на сила. В апарат 2 тестовите обекти бяха спуснати в ваните с органи, пълни с Tyrode. Органните бани също бяха настроени на температура 37 ° С и газови. Предварително напрежение беше приложено чрез фино задвижване, след това контракцията беше принудена и тези контракции или промени в тях бяха преобразувани в текущи сигнали и записани. 21-ви
27 Фигура 9: Скица на апарата 2 22
28 Фигура 10: Оригинална илюстрация на апарата Силов преобразувател С помощта на силовия преобразувател механичните промени се преобразуват в електрически чрез така наречения мост на Уитстоун, което прави измерването възможно. В преобразувателя на сила има стрии. Когато имаше промени в силата на свиване на органите, съпротивлението на удължаване и текущия поток също се променяха пропорционално. Промените в свиването и отпускането на мускулите могат да бъдат пренесени на плосък рекордер (Flatbed Recorder модел BD 112, от компанията World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA) чрез усилвател (Transbridge TM, 4-Channel Transducer Amplifier, от World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA) Kipp & Zonen). Това прехвърля импулсите към милиметрова хартия. 23.
29 Фигура 11: Скица на преобразувателя на сила Захранване с карбоген Във всички експерименти е необходимо постоянно снабдяване на органите с карбогенов газ, за да се постигне достатъчно количество кислород, равномерна смес от активното вещество и да се поддържа постоянната стойност на рН. Това стана възможно с помощта на маркуч, свързан към всяка баня с органи. Стъклените фрити бяха точно пред входа на баните. Те позволиха фино пулверизиране и, заедно със скоби в началото на маркучите, оптимална доза въздух. Фигура 12: Оригинално изображение на газоснабдяването 24
33 KCl взети и разтворени в 100 ml Tyrode. Тук има и бързо свиване, което също толкова бързо отново намалява. Човек изчака около 45 минути, докато се образува стабилна фаза на платото. Веществото се добавя отново съгласно известната схема на белодробна артерия (белодробна артерия). Ходът на експеримента е същият като при аортата, единствената разлика е в напрежението, което винаги е било постоянно при 5 mV, т.е. 9,81 mn, е изследване на механизма на действие на MAH 4HCL върху червата Изследвания с глибенкламид и нитро-L-аргинин Червата се приготвя, както е описано в главата, и се закрепва към апарат 2. За хода на експеримента вижте глава Тук изчакахте, докато се установи фазата на постоянното плато, след това бяха добавени антагонистите глибенкламид или нитро-L-аргинин, като крайната концентрация в банята за органи е 100 µmol/l. След 45 минути се добавят 15 μl изходен разтвор и се оставя да действа още 45 минути, след което експериментът приключва. Глибенкламид Фигура 13: Глибенкламид (MW = 494,0 g/mol) 28
36 нулева линия. По този начин можете да сравните стойностите пропорционално. За това трябваше да се вземе предвид калибриращ фактор, който съответстваше на 5 mv за 1 cm или 0,98 mn. Ако сте работили при 2 mv, стойността трябва да се умножи по 0,2 и при 10 mv по 2 Статистика. За статистическата оценка на силата на свиване и честотата на ударите се изчисляват средните стойности и стандартната грешка на средните стойности (SEM). За изчисляване на тези статистически стойности и EC50 е използвана програмата Sigma Plot 9.0. Тази програма обяснява средната ефективна концентрация на активната съставка в mmol/l, при която е достигната половината от контролната стойност. За да се наблюдава вероятността от грешка, беше извършен t-тест на Student за сдвоени наблюдения. Стойности под 0,1% (P 0,001) бяха силно значими и стойности от 5% (P 0,05), 1% (P 0,01) бяха значими. Стойностите с вероятност за грешка> 5% (P> 0,05) не са значими стойности. 31
38 Таблица 5: Резултати от теста на MAH 4HCl в дясното предсърдие MAH4HCL f ± SEM f ± SEM (µmol/l) (x/min) (%) Брой опити за вероятност за грешка (P) n Контрол 180 ± 8,66 0 ±, 50 ± 8,54 1,52 ± 2,60 4 ns, 50 ± 12,50-1,18 ± 5,08 4 ns ± 9,24-15,27 ± 3,87 4 0, ± ± 0 4 0,001 В Таблица 5 показва средните аритметични стойности (f) в уд/мин и в проценти, както и техните стандартни грешки (SEM) за съответната концентрация. n е броят на опитите. 33
39 Диаграма 1: Крива на концентрация-ефект на MAH4 HCl в дясното предсърдие AURRO n = 4 MAH 4 HCL EC 50 = 49 µmol/l 25 Намаляване на честотата на ударите (%) Conc. (Μmol/l) Тази диаграма показва промяната в честотата на ударите като функция количеството вещество в органна камера. Честотата на удара е въведена в% върху оста y и концентрацията на изпитваното вещество върху оста x. Стойността на ЕС 50 е показана с пунктирани линии и е 49 μmol/l. Точките показват изчислените средни стойности на честотата на ударите при съответните концентрации, а лентите показват техните стандартни грешки. 34
40 Фигура 15: Оригинален запис на хронотропния ефект на MAH4 HCl 12 сек 1 cm = 0,98 mn Отрицателният хронотропен ефект може да се прочете от броя на ударите. 35
4.1.2 Musculus папиларис Проведени са четири експеримента за оценка на инотропния ефект върху папиларния мускул. Контролната стойност беше 1,58 ± 0,45 mn. Добавянето на веществото доведе до намаляване на силата на свиване. При концентрация от 3 µmol/l това намаление е -15,05 ± 8,34% и става все по-голямо и по-голямо. При крайна концентрация от 100 µmol/l, силата на свиване е 0,08 ± 0,02 mN или 94,92 ± 1,58% от контролната стойност. Таблица 6: Ефект на MAH 4HCl върху папиларния мускул MAH4HCL fc ± SEM fc ± SEM (µmol/l) (mn) (%) Брой на вероятността от опити за грешка (P) n контрол 1,58 ± 0,45 0 ±, 23 ± 0 .43-15.05 ± 8.34 4 0, 99 ± 0.36-40.46 ± 5.70 4 0, 57 ± 0.19-65.92 ± 3.05 4 0.08 ± 0,02-94,92 ± 1,58 4 0,001 Тази таблица показва средните аритметични стойности (fc) и тяхното стандартно отклонение (SEM) при концентрация, налична както в mn, така и в проценти. 36
42 Диаграма 2: Крива на концентрация-ефект на MAH4 HCl върху папиларния мускул 0 МАШИНА НА ПАПИЛАР MAH 4 HCl n = 4 EC 50 = 15 µmol/l намаление на силата на свиване (%) конц. (Μmol/l) Тази диаграма показва промяната в силата на свиване като функция на количеството вещество в органна камера. Намаляването на силата на свиване в% беше въведено по оста y, а концентрацията на изпитваното вещество в μmol/l върху оста x. Стойността на ЕС 50 е показана с пунктирани линии и е 15 μmol/l. Точките показват изчислените средни стойности на силата на свиване при съответните концентрации, а стълбовете показват техните стандартни грешки. 37
43 Фигура 16: Оригинален запис на инотропния ефект на MAH4 HCl 1 cm = 0,98 mn Намаляването на силата на свиване може да се види ясно в дължината на амплитудата. Дължината на амплитудата намалява с увеличаване на концентрацията на изпитваното вещество в органната камера, което се основава на отрицателния инотропен ефект на изпитваното вещество. 38