56-та нефректомия в комбинация с диета с високо съдържание на сол и инхибиране на синтазата на азотен оксид за предизвикване
Обобщение
Описана е двуетапна процедура за установяване на хронична бъбречна недостатъчност (CRF) при плъхове на Луис чрез хирургично отстраняване на 5/6-та част от бъбречната маса. Комбинацията от хирургическа интервенция, инхибиране на NOS и диета с високо съдържание на сол води до модел, подобен на човешкия ХБН, позволяващ изследване на причинно-следствените механизми и разработване на нови терапевтични интервенции.
Резюме
Въведение
Поради прогресивния си характер, последващия краен стадий на бъбречно заболяване и свързаната сърдечно-съдова заболеваемост и смъртност, ХБН е нарастващ проблем на общественото здраве. Следователно забавянето на прогресията на ХБН е голям здравен приоритет. Тъй като ХБН се характеризира със сложни нарушения на хомеостазата, интегративни животински модели са необходими за изследване на развитието и прогресията на ХБН. Бъбрекът е изграден от множество различни видове клетки, които взаимодействат помежду си. Тази сложност не може да бъде имитирана in vitro.
Протокол
Всички експерименти се провеждат в съответствие с етичните насоки за експериментални животни на Комитета за лабораторни животни в Утрехт. Протоколът се провежда под ръководството и одобрението на авторската институция за грижа и употреба на животните.
ХБН се предизвиква при мъжки инбредни плъхове Lewis (Charles River, Sulzfeld, Германия) на възраст 8 седмици. Плъховете се настаняват при стандартни условия в среда с контролирана светлина, температура и влажност.
- Стерилизирайте хирургически инструменти:
- 1 ученик форцепс 1-2 зъба 12 см
- 1 клещи със стандартен шаблон за ученици
- 2 клещи Semken
- 1 ножица Mayo
- 1 ученическа ножица Iris
- 1 Поставка за игла Olsen-Hegar с ножица
- Одеяло
- Проверете списъка с инвентара:
- Операционна маса с подгряваща подложка и лампа
- O 2, изофлуран
- тъкан
- Самобръсначка
- Везни
- Стерилна работна точка
- Стерилна марля 5х5 и 10х10
- 70% алкохол
- 0.9% разтвор на NaCl
- 1 ml спринцовка
- Игли (25G)
- Подложки от гелна пяна: Спонгостан
- Vicryl 4.0 и 5.0
- Бупренорфин 0,03 mg/kg (разреден 1:10 във физиологичен солев разтвор)
- Почистете клетката за плъхове след операция
2. Унинефректомия от дясната страна
3. Субтотална нефректомия за лявата страна
- Седем дни по-късно се правят същите препарати отляво за дясната страна, както е описано от 2.1 до 2.5. Преди операцията се изчислява количеството бъбречна тъкан, което трябва да се отстрани, което е приблизително 2/3 от теглото на десния бъбрек. Пригответе малки парченца гелна пяна (Спонгостан, Джонсън и Джонсън, Ню Джърси) преди операцията.
- Поставете остри ножици около горния полюс на левия бъбрек и резекция на горния полюс с един удар (за местоположението на ножицата вж. Фигура 3). Покрийте веднага с парче гел пяна и приложете лек натиск със стерилна марля.
- Повторете с долния полюс на бъбрека, както е в 3.3.
- Повдигнете бъбрека, за да предотвратите съсирването на кожата. Поддържайте лек натиск върху двете подложки с гелна пяна със стерилна марля, докато кървенето спре. Ако кървенето продължава, добавете още една пяна.
- Поставете остатъчния бъбрек с лепящи гел пяна в областта на корема. Затворете мускулите и кожата и следвайте 2.9-2.12.
- Фалшивото наблюдение беше подложено на същата процедура за излагане на бъбреците. Вместо да се изкорени бъбреците или да се режат пръчките една седмица по-късно, и двата бъбрека се декапсулират с интервал от една седмица, без да се притесняват да нарушават надбъбречните жлези. Затварянето на рани и следоперативните грижи са идентични до 2.11 и 2.12.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.
Представителни резултати
След субтоталната нефректомия е приблизително 1: 6 от общата остатъчна бъбречна маса. Фигура 4 показва теглото на отстранената част на десния бъбрек със средно и стандартно отклонение в два предишни експеримента. Трябва да се има предвид, че през седмицата след UNX настъпва хипертрофия на левия бъбрек, което показва, че теглото, което трябва да се изчисли на базата на теглото на десния бъбрек, винаги води до по-малко от 5/6-то разстояние. Тъй като обаче не е възможно да се определи теглото на левия бъбрек по време на операция, това е точният начин за отстраняване на около 5/6-та от първоначалната бъбречна маса.
С течение на времето плъховете с ХБН развиват хипертония, уремия, анемия, протеинурия и значително намаляване на GFR и ERPF. След 6 седмици се установи ХБН, подходящ момент за тестване на спасителните мерки. С течение на времето се наблюдава рязка прогресия на хипертония и протеинурия, докато хематокритът и бъбречната функция (GFR и ERPF) показват леко влошаване (Фигура 5). Други симптоми, върху които не се фокусирахме в нашите експерименти, са нарушения в метаболизма на калциевия фосфат и липидите и много други. В зависимост от стреса върху плъховете, развитието на ХБН може да варира значително 14, 15, 2. Използвахме диета с високо съдържание на сол и NO-блокер, за да индуцираме високо кръвно налягане и ендотелна дисфункция.
Прогресията на бъбречната недостатъчност се проследява чрез събиране на урина (използвана за измерване на количеството протеин и креатинин), кръв (плазмен карбамид и креатинин) и систолично кръвно налягане. Наясно сме, че развитието на високо кръвно налягане може да бъде по-точно проследено, когато се използва телеметрия вместо плетизмография на маншета. Креатининовият клирънс може да бъде изчислен, но има тенденция да подценява намаляването на GFR поради обширна тубуларна секреция на креатинин при плъхове 16, подчертавайки значението на златния стандартен метод за определяне на бъбречната функция чрез определяне на клирънса на инулин и PAH 17, 18, 19 . Koeners и сътр. описа цялата процедура 20. Клирънсът на инулин и PAH, изчислен от тяхната концентрация в пробата от урина (U), скоростта на потока на урината (V) и тяхната плазмена концентрация (P). Преди това демонстрирахме значително намаляване на GFR и ERPF в този модел, използвайки класическа технология на клирънс, докато това беше по-малко очевидно от промените в плазмения креатинин, плазмения карбамид или креатининовия клирънс 13.
98fig2.jpg "/>Фигура 2. Дисекция на надбъбречната жлеза. За да премахнете надбъбречната жлеза, без да я безпокоите, поставете форцепс в мазнината между бъбрека и надбъбречната жлеза и се придвижете от полюса на съда нагоре към върха, като сочи през червената линия. Илюстрация, адаптирана от 20-то американско издание на „Анатомия на ужаса на човешкото тяло“, 1918 г.
Дискусия
Хирургично отстраняване на 5/6-та част от бъбречната маса при плъхове Луис, комбинирано с диета с високо съдържание на сол и временно инхибиране на NOS води до модел на ХБН, който прилича на човешки ХБН и позволява изследване на причинните механизми и ефективността на терапевтичните интервенции при ХБН.
Моделът 5/6-та нефректомия е добре познат и широко описан модел за ХБН. Обаче простото отстраняване на 5/6 от бъбречната маса не води веднага до бъбречна недостатъчност при всички щамове на плъхове. Използваме плъхове Lewis, за да изследваме ефектите на клетъчно базирани терапии при ХБН, тъй като наличието на GFP + Lewis плъхове може да проследява 21 клетки, администрирани донорски клетки в реципиент (nonGFP +) плъх. Плъхът Луис е относително устойчив на развитието на бъбречна недостатъчност и развитието на ХБН е бавно в сравнение с други щамове 22, 15. Следователно отстраняването на 5/6-та бъбречна маса се комбинира с изчерпване на NO и диета с високо съдържание на сол, тъй като това прилича на няколко аспекта на човешката ХБН, като висок прием на сол и ендотелна дисфункция. Читателите трябва да имат предвид, че необходимостта от комбинацията 5/6-та нефректомия с високосолена диета и/или липса на умора зависи от щама на плъховете, използвани за експериментите.
Извършихме 5/6-та нефректомия в двуетапна процедура, а не в едноетапна, тъй като това се счита за по-малко стресиращо за животното, свързано е с по-малка хирургична смъртност и е предпочитано от нашия експериментален комитет по животни. Предпочитахме фланговия разрез, а не лапатомията, за да достигнем до бъбреците, тъй като лапаротомията е свързана с по-висок риск от инфекция на рани, разхлабване на шевовете, подкожна дискова херния и сраствания на червата в сравнение с фланговия разрез. Освен това, ако експерименталният дизайн включва интервенция с коремен разрез - какъвто е случаят в нашите експериментални проучвания върху приложението на клетки от костен мозък в бъбречната артерия на остатъчните бъбречни лапаротомии за SNX не се застъпва, тъй като повторните лапаротомии трябва да се избягват.
Няколко критични проблема могат да възникнат след хирургично отстраняване на 5/6 от бъбречната маса. По време на UNX може да има затруднения при стабилизиране на бъбреците, тъй като околната мазнина ще се разхлаби лесно. За излагане на бъбреците могат да се използват два метода. 1) Използвайте по-малки форцепс, за да се хванете за бъбречните съдове, като внимателно ги придвижите надолу от долния полюс на бъбрека към васкулатурата и издърпвате внимателно, докато можете да стабилизирате бъбрека. 2) Използвайте тъпи форцепс, за да отстраните внимателно бъбрека от корема си. Когато бъбрекът е изложен, марлята може да се използва за спиране на кървене, което се появява по време на този процес. За да се избегне кървене, мазнината започва да се дърпа в долния полюс на бъбрека, където мазнината е силно прикрепена към бъбрека.
Важно е да се създаде между възела около бъбречния съд и бъбрека, за да се предотврати кървенето след отстраняване на бъбрека, тъй като възелът се изплъзва от бъбречните съдове поради входящия кръвен поток, бързо запълвайки корема с кръв. Може да се използва марля за отстраняване на кръвта и да се приложи натиск за спиране на кървенето. Използвайте форцепс, за да хванете бъбрека и да създадете нова лигатура. Ако бъбречните съдове не могат да бъдат проследени, задръжте натиск, докато кървенето спре. 1 ml физиологичен физиологичен разтвор за предотвратяване на дехидратация поради кървене в коремната кухина и изчакайте около 5 минути, преди да затворите мускулния и кожен слой. Следете допълнително внимателно плъховете през следващите дни. Ако превръзката съществува преди, след отстраняване на бъбреците, но бъбречните съдове текат, дългите краища на лигатурата могат да се използват за връзване на съдовете.
Ако след дисекция на полюса, въпреки задържането на натиск върху подложките от пяна гел, ако има кървене, това е вероятно поради нараняване на голяма бъбречна артерия или бъбречно легенче. Това кървене може да бъде спряно чрез поставяне на нови подложки с гел пяна върху раната, без да се притеснявате да преместите пяната, докато повдигате остатъка, тъй като по-големите съдове са близо до пъпа, и изчаквате за по-дълъг период от време.
Кръвта в урината може да се върне до 2 дни след операцията. Ако бъбречното легенче е увредено или има голямо бъбречно функционално кървене, ще има следа от постоянна хематурия. Плъхове с персистираща хематурия след операция трябва да бъдат евтаназирани, тъй като не е възможно да се спре кървенето. Ако се наблюдава хематурия по-късно във времето след операцията, която може да се появи до 2 седмици след операцията, плъхът също трябва да бъде евтаназиран, тъй като кръвта се съсирва в бъбречното легенче и в крайна сметка запушва уретера и пикочния мехур, причинявайки запушване.
Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.