Университет в Шербрук

Université de Sherbrooke Регулиране на P2X7 рецептора от глюкоза и нейните C/EBPa ефектори и чревни епителни клетки в Програма на клетъчната биология на Maude Bilodeau Дисертация, представена пред Факултета по медицина и здравни науки с оглед получаване на степента на магистър (M .Sc.) В клетъчната биология Шербрук, Квебек, Канада * 26 ноември 2012 г. Членове на оценителното жури проф. Femand-Pierre Gendron, катедра по анатомия и клетъчна биология проф. Клод Аселин, катедра по анатомия и клетъчна биология проф. Алфредо Менендес, Катедра по микробиология Мод Билодо, 2013

университет

Т а б л е на те р СЪДЪРЖАНИЕ. IV СПИСЪК НА ФИГУРИТЕ. VII СПИСЪК НА МАСИ. IX СПИСЪК НА СЪКРАЩЕНИЯТА. X ВЪВЕДЕНИЕ. 2 1. L in t e s t in. 2 1.1 Ф о н ц и о н и ст р у к т у р е г е н е р а л е. 2 1.2 L a x c r y p t e v il l o sity. 4 1.3 A b so r p t io n e t r é g u l a t io n by g l u c o s e. 7 2. ЕКСТРАКЕЛУЛАРЕН АДЕНОЗИН 5 ТРИФОСФАТ. 11 3. Приемане на eur rspur в erg ic P 2 se ns ib les à L A T P. 13 3.1 Lecept eu r P 2 X 7. 16 3.2 F unction on the P приемник 2 X 7. 18 4.0 L atranscr ip t io n. 19 4.1 Принципи на работа. 19 5.0 Факторите на C/E B P. 2 0 5.1 C/E B P a. 2 0 5.1.1 Изофо р м е с е т л о к а л е а т ио н. 2 0 5.1.2 Ф о н ц и я. 21 5.1.3 M o d e d e g u l a t io n d o t e n t ie l t r a n s c r ip t io n n e l. 21 5.2 C/E B P стр. 2 2 5.2.1 Изофо р м е и л о к а л е а тио. 22 5.2.2 Забавни функции. 22 5.2.3 M o d e d e g u l a t io n d u p t e n t ie l t r a n s c r ip t io n n e l. 23 ХИПОТЕЗА. 25 МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ. 26 1. M o d è l e s c e l l u l a ir e s. 26 1.1 C a c o - 2. 26 1.2 H E K 2 9 3 T. 26 1.3 IE C -6. 27 2. M o d è l e o u r is. 27 2.1 S o u r е C/E B P p in v a l idé e. 27 2.2 Коефициентът е NOD. 27

VI 4. Ефект от g l u c o se u r th e x p r e s s io n d e f a c t e u r s C/EBPa e t p d a n s th IEC-6 КЛЕТКИ. 50 5. Ефект на глюкозите върху e x p r e s sio n o f C/EBPa e f a c t e u rs в CACO-2 КЛЕТКИ. 52 6. Ролево на C/EBPa И P s u r l a t r a n s a c iw a tio n o f P2X7 p r o m o t ers. 54 7. Капацитет на C/EBPp a c t r a c t io n f a c t io n a u r p r o m o t в P2X7 В ГЛЮКОЗНО-СТИМУЛИРАНИ КАКО-2 КЛЕТКИ. 56 8. Ефект на изолацията на C/EBPa и LIP на преглед на C/EBPP на системата за промотор P2X7. 59 9. D e r m in a t io n o f th e c a p a c it e o f r e c e p t e u r P2X7 в КЛЕТЕН МОДЕЛ, ИНВАЛИДИРАН ЗА ФАКТОРА ЗА ТРАНСКРИПЦИЯ C/EBPP. 62 10. Im pactofin val id a tio nof of C/EBPp express io n in the sour is surl ex pr e sion OF P2X7, GLUT2 AND C/EB Pa. 64 11. Im pa ctdud ia b è tesurl 'express io ndufacteurdetran sc r ip t io n C/EBPp, P2X7 ПРИЕМНИК И ГЛУТ2 ТРАНСПОРТЕР В МОДЕЛА НА NOD MOUSE. Вината! Неопределен флаг i. ДИСКУСИЯ. 73 ПРИЗНАВАНИЯ. 83 ЛИТЕРАТУРА. 84

Таблица 1: Праймери, използвани за Q-PCR анализи. 29 Таблица 2: Списък на първичните антитела, използвани за имуноблоти. 31 Таблица 3: Списък на вторичните антитела, използвани за имуноблоти. 32 Таблица 4: Праймери, използвани за PCR амплификация на човешкия промотор P2X7R. 33 Таблица 5: Праймери, използвани за PCR амплификация на пресечения човешки промотор P2X7R. 36 Таблица 6: Конструкции на промотора P2X7. 39

L is tedesabr é v ia t io ns AC ADP DNA AMP c RNA ATP BzATP C/EBP ChIP CREB DAG ERK G-CSF GLUT IL IP3 LAP LIP MAPK NOD NF-kB oatp P300/CBP PKA PKB PKC PI3K PLC adenylate ciclapha adenylate cyclaphate екстрацелуларен дипосфат дезоксирибонуклеинова киселина Цикличен AMP рибонуклеинова киселина аденозин 5 трифосфат 2,3-о- (бензоил-4-бензоил) -atp CCAAT/усилващ свързващ протеин хроматин имунопреципитационен лагер-отговор-свързващ елемент протеин диацилглицерол Извънклетъчен сигнал регулирани кинази колонални колони стимулиращ фактор глюкозни транспортери интерлевкин инозитол 1,4,5-трифосфат Чернодробно активиращ протеин Чернодробен инхибиторен протеин Митоген-активиран протеин киназа не затлъстял диабет ядрен фактор-каппа В аденозин 5-трифосфат периодат окислен p300/CREB свързващ протеин киназа А протеин киназа В протеин киназа С фосфоинозитид-3-киназа фосфолипаза С

XI Q-PCR количествена полимеразна верижна реакция Rb ретинобластом Ser serine SGLT1 транспортер натрий-глюкоза 1 STAT преобразуватели на сигнала и активатори на транскрипция T IR рецептор за вкус тип 1 TB P TATA кутия свързващ протеин Thr треонин TNF тумор некроза фактор WT див тип

3 СТРОИТЕЛНА СИСТЕМА Жлъчен мехур Р. Езофаг Черен дроб Дванадесетопръстник Възходящо дебело черво Черва Стомашна жлеза Панкреас Напречно дебело черво Низходящо дебело черво Sigmolde Rectum Фигура 1: Храносмилателната система. Храносмилателната система включва няколко органа, показани на тази диаграма, а именно устата, хранопровода, стомаха, черния дроб, панкреаса, тънките черва, дебелото черво и ануса (модифициран от http://www.maalox.fr.). y * '.; -v. Анус

5 апикалната мембрана, гликокаликсът. Този защитен слой се формира от набор от захари, присъстващи в мембранните протеини. Гликокаликсът предпазва от ензими и химикали, намиращи се в лумена на червата (Becker et al., 2010). От друга страна, както можем да видим на фигура 2, има няколко други специализирани клетъчни типа, отговорни за различни функции, важни за целостта на органите (Alberts et al., 2008). В допълнение към ентероцитите, ние откриваме бокалови клетки във вилуса. Тези клетки са отговорни за секрецията на слуз, която държи чревната флора далеч от епитела и смазва чревното съдържимо, за да улесни движението на храната (Cheng, 1974). Съществуват и ентероендокринните клетки, които образуват много голям ендокринен орган. Те са отговорни отчасти за правилното функциониране на червата и за комуникацията с други органи, включително панкреаса и черния дроб (Roth and Gordon, 1990). Има 20 вида ентероендокринни клетки, които са специализирани в секрецията на различни хормони. Например, S-тип клетки предимно секретират секретин (Bloom and Fawcett, 1986).

6 Anjflbinoaafr pnumctcn <> (Scw # De "Cors *" 9 "E nwoendocnne Gobtet m" tuft Enterocyte M-Cells * AWI1 Фигура 2: Диференциращ модел на различните типове чревни клетки. Диаграмата вляво представлява оста на криптата-вилус както и че различните клетъчни типове и диаграмата вдясно представляват различните сигнали, които регулират диференциацията на клетъчните типове, присъстващи в червата (Gerbe et al., 2011).

9 ПРЕДИ НИСКО ЛЯКО НИСКО НИСКО ХРАНЕНЕ Ниска концентрация на захар ЛЕКА КРЪВ Голяма концентрация на захар КРЪВ 2 N a \, 2N има малко, глюкоза 5 mm глюкоза много глюкоза mako se _ от М диета базолатерално много глюкоза g read co se Фигура 3: Създаден механизъм за усвояване на чревната глюкоза преди и след хранене. (А) Преди хранене, цялата глюкоза се улавя от транспортера SGLT1 в апикалната мембрана на ентероцитите. Транспортерът Glut2 е локализиран на базолатерално ниво и позволява транспортирането на глюкоза от кръвта към ентероцитите, за да поддържа техния енергиен резерв. (B) След хранене, Glut2 бързо се вкарва в апикалната мембрана на ентероцитите от вътреклетъчните везикули и се превръща в основния компонент на усвояването на захарите. На базолатерално ниво Glut2 позволява излизането на глюкоза и фруктоза в кръвния поток. (Променено от Kellett and Brot-Laroche, 2005).